小組組長方剛

1、RNA干擾干擾 （RNA interference，RNAi） 007小組小組組長：方剛組長：方剛 組員：張科強(qiáng)組員：張科強(qiáng) 范宇巧范宇巧 田甜田甜 肖鵬肖鵬 車斌車斌ContentsRNAi的發(fā)現(xiàn)簡史的發(fā)現(xiàn)簡史1RNAi的相關(guān)知識(shí)的相關(guān)知識(shí)2RNAi的分子機(jī)制的分子機(jī)制3RNAi的應(yīng)用前景的應(yīng)用前景4RNAi的實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)方法5諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)發(fā)布的公報(bào)說，法爾和梅洛獲獎(jiǎng)是因?yàn)樗Z貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)發(fā)布的公報(bào)說，法爾和梅洛獲獎(jiǎng)是因?yàn)樗麄儌儭鞍l(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動(dòng)的基本機(jī)制發(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動(dòng)的基本機(jī)制”。公報(bào)指出，。公報(bào)指出，RNARNA干擾已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未

2、來幫干擾已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未來幫助科學(xué)家開發(fā)出治療疾病的新療法。助科學(xué)家開發(fā)出治療疾病的新療法。梅洛梅洛(Craig Mello)生于生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石。從那時(shí)起，他就西部尋找化石。從那時(shí)起，他就迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時(shí)代，類生命的起源等問題。高中時(shí)代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面。程方面。法爾法爾(Andrew Fire)1959年出年出生在美國加利福尼亞

3、州，本科在生在美國加利福尼亞州，本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用數(shù)學(xué)，僅用3年時(shí)間就拿到學(xué)位。年時(shí)間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對(duì)涉及生命與梅洛類似，他逐漸對(duì)涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。06年獲獎(jiǎng)時(shí)，梅洛年獲獎(jiǎng)時(shí)，梅洛46歲，法爾歲，法爾47歲，在歷代諾貝爾獎(jiǎng)獲得者歲，在歷代諾貝爾獎(jiǎng)獲得者中，是年齡偏低的，而且他們從科學(xué)發(fā)現(xiàn)到獲獎(jiǎng)還不足中，是年齡偏低的，而且他們從科學(xué)發(fā)現(xiàn)到獲獎(jiǎng)還不足年的時(shí)間，這在諾貝爾獎(jiǎng)歷史上還屬罕見。諾貝爾生理學(xué)或年的時(shí)間，這在諾貝爾獎(jiǎng)歷史上還屬罕見

4、。諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)委在現(xiàn)場解析今年的獲獎(jiǎng)成果時(shí)說：醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)委在現(xiàn)場解析今年的獲獎(jiǎng)成果時(shí)說：這是諾貝爾獎(jiǎng)這是諾貝爾獎(jiǎng)首次不發(fā)給一個(gè)擁有答案的研究，相反，干擾機(jī)制為首次不發(fā)給一個(gè)擁有答案的研究，相反，干擾機(jī)制為我們提出的是更多需要解答的問題，為基因技術(shù)研究提供了我們提出的是更多需要解答的問題，為基因技術(shù)研究提供了令人興奮的可能性。令人興奮的可能性。 這樣一個(gè)讓諾貝爾獎(jiǎng)都為之破例的偉大發(fā)現(xiàn)，究竟這樣一個(gè)讓諾貝爾獎(jiǎng)都為之破例的偉大發(fā)現(xiàn)，究竟經(jīng)歷了哪些歷程，就這么快就被科學(xué)界承認(rèn)了呢？經(jīng)歷了哪些歷程，就這么快就被科學(xué)界承認(rèn)了呢？下面就讓我們來看看下面就讓我們來看看RNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史。干擾的發(fā)現(xiàn)簡

5、史。一、一、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史干擾的發(fā)現(xiàn)簡史 94年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為(quelling)。90年代初，美國和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組Rich Jorgensen和同事,在對(duì)矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個(gè)奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個(gè)能產(chǎn)生色素的基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。也就是說轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為(cosuppression) 野生型野生型試驗(yàn)試驗(yàn)預(yù)測預(yù)測06年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C布后

6、來自英國劍橋大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，以及比利時(shí)法蘭德斯大學(xué)校際生物科技研究所的三名科學(xué)家向英國著名的Nature雜志寄出的一封信中，表示了他們對(duì)于此次RNAi獲得諾貝爾獎(jiǎng)的遺憾之處植物RNAi研究領(lǐng)域科學(xué)家沒有能包括在這一獎(jiǎng)項(xiàng)中這足以說明，植物領(lǐng)域科學(xué)家們這足以說明，植物領(lǐng)域科學(xué)家們?cè)谠赗NAi發(fā)現(xiàn)和機(jī)制闡述方面做發(fā)現(xiàn)和機(jī)制闡述方面做出的關(guān)鍵性作用出的關(guān)鍵性作用Rich Jorgensen一、一、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史干擾的發(fā)現(xiàn)簡史 1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本想利用反義反義RNARNA

7、技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義正義RNARNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。 論文：論文：Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.一、一、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史干擾的發(fā)現(xiàn)簡史 1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mello首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的。他們發(fā)現(xiàn)Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的

8、反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNARNA干擾干擾。 論文：論文：Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.一、一、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史干擾的發(fā)現(xiàn)簡史 在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、

9、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物中細(xì)胞。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2000年提出RNAi作用機(jī)制模型。論文：論文：Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-332001年，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494498此后，RNA干擾技術(shù)迅速興起并掀起了一股生物技術(shù)熱潮，在20002003年間，連續(xù)4年被列入世界十大科技進(jìn)步世界十大科技進(jìn)步之一。Science

10、e曾將RNAi評(píng)為2002年十大科技進(jìn)步之首。麻省理工大學(xué)的生物學(xué)家，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者菲利普 夏普認(rèn)為，RNAi技術(shù)將成為十年來甚至幾十年來最重要和激動(dòng)人心的科學(xué)突破一、一、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)簡史干擾的發(fā)現(xiàn)簡史線蟲體內(nèi)的RNAi線蟲中RNAi效應(yīng)的檢測（左面）兩條線蟲表現(xiàn)為綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)類型品系，該品系含有一個(gè)普遍性表達(dá)的GFP報(bào)告基因重組質(zhì)粒（帶有核內(nèi)定位信號(hào)位點(diǎn)）。（右面）喂食表達(dá)針對(duì)GFP的dsRNA的細(xì)菌后，整個(gè)蟲體的GFP信號(hào)消失。LOGORNAi的定義的定義 如果將如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義目前對(duì)目前對(duì)RNAi (RN

11、A interference)的定義有很多的定義有很多種，不同的資料對(duì)其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同種，不同的資料對(duì)其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同 RNAi是由是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。 RNAi是有是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外

12、源基因?qū)牖虿《救肭趾螅?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒細(xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。因沉默的現(xiàn)象。 LOGORNAi的定義的定義 RNAi 是指通過是指通過反義反義RNA與正鏈與正鏈RNA 形成雙鏈形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象因的現(xiàn)象,它通過人它通過人為地引入與內(nèi)源靶為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列基因具有相同序列的雙鏈的雙鏈RNA(有義有義RNA 和反義和反義RNA) ,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的因的mRNA 降解降解,達(dá)達(dá)到阻止基因表達(dá)的到阻止基因表達(dá)的目的目的。 RNAi是指體外是指體外人工合成的或體內(nèi)

13、人工合成的或體內(nèi)的雙鏈的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與胞內(nèi)特異性的將與之同源的之同源的 mRNA降解成降解成21nt23nt 的小片段，使相應(yīng)的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。的基因沉默。 RNAi是將與靶基是將與靶基因的因的mRNA 同源互同源互補(bǔ)的雙鏈補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入導(dǎo)入細(xì)胞細(xì)胞,能特異性地降能特異性地降解該解該mRNA ,從而產(chǎn)從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型生相應(yīng)的功能表型缺失缺失, 屬于轉(zhuǎn)錄后水屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為如果將

14、其作為一門生物技術(shù)，則定義為：LOGOv我們不惜花費(fèi)這樣的篇幅給同學(xué)們介紹我們不惜花費(fèi)這樣的篇幅給同學(xué)們介紹RNAi的發(fā)現(xiàn)史，一來是希望同學(xué)們能了解這項(xiàng)偉的發(fā)現(xiàn)史，一來是希望同學(xué)們能了解這項(xiàng)偉大發(fā)現(xiàn)的來龍去脈，知道那些曾為此做出過大發(fā)現(xiàn)的來龍去脈，知道那些曾為此做出過貢獻(xiàn)的科學(xué)家，二來也是希望能引起同學(xué)們貢獻(xiàn)的科學(xué)家，二來也是希望能引起同學(xué)們對(duì)對(duì)RNAi的興趣。的興趣。接下來，我們將為同學(xué)們介紹的是接下來，我們將為同學(xué)們介紹的是RNAi的相的相關(guān)知識(shí)，例如前面所提到過的反義關(guān)知識(shí)，例如前面所提到過的反義RNA和基和基因沉默等。這是同學(xué)們可能不太了解，但是因沉默等。這是同學(xué)們可能不太了解，但是對(duì)

15、于理解對(duì)于理解RNAi的分子機(jī)制又必不可少的東西。的分子機(jī)制又必不可少的東西。LOGO基因沉默基因沉默反義反義RNADICER酶酶MicroRNASiRNA基因沉默（gene silencing）基因沉默是指生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)?；虺聊侵干矬w中特定基因由于種種原因不表達(dá)。兩種方式：兩種方式： TGS （transcriptional gene silencing） PTGS (post-transcriptional gene silencing)在這兩種水平上引起的基因沉默都與基因的同源性有在這兩種水平上引起的基因沉默都與基因的同源性有關(guān)，稱為同源依賴性的基因沉默。關(guān)，稱

16、為同源依賴性的基因沉默。(homology-dependent gene silencing,HDGS）。LOGO基因沉默基因沉默（gene silencing）v一方面，基因沉默是遺傳修飾生物一方面，基因沉默是遺傳修飾生物（genetically modified organisms）實(shí)用化和商品化的巨大實(shí)用化和商品化的巨大障礙障礙。v另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一個(gè)本另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一個(gè)本能反應(yīng)，為用抗病毒基因植物工程育種提供能反應(yīng)，為用抗病毒基因植物工程育種提供了具有較大潛在實(shí)用價(jià)值的策略了具有較大潛在實(shí)用價(jià)值的策略RNA介介導(dǎo)的病毒抗性。導(dǎo)的病毒抗性。LOGO反義反

17、義RNA 反義反義RNA是指與是指與mRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的RNA分子（也包括分子（也包括與其它與其它RNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的RNA分子）分子） 由于核糖體不能翻譯雙鏈的由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義，所以反義RNA與與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合特異性的互補(bǔ)結(jié)合, 即抑制了該即抑制了該mRNA的的翻譯。翻譯。細(xì)胞中反義RNA的來源有兩種途徑第一是反向轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在多數(shù)情況下, 反義RNA是特定靶基因互補(bǔ)鏈反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 即產(chǎn)生mRNA和反義RNA的DNA是同一區(qū)段的互補(bǔ)鏈。第二種來源是不同基因產(chǎn)物，如OMPF基因是大腸桿菌的膜蛋白基因，與透性有關(guān)，其反義基因MICFZE則為另一基因。LOGO反義

18、反義RNA的分類和作用機(jī)制的分類和作用機(jī)制類類:這類反義RNA直接作用于其靶mRNA的編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制(A類)或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對(duì)RNA酶的敏感性增加，使其降解(B類)。類類:這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機(jī)制尚不完全清楚類類:這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。LOGOdicerDicer是RNaseIII家族中的一員,是特異識(shí)別雙鏈RNA的核酸內(nèi)切酶LOGO四個(gè)結(jié)構(gòu)域：Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域，III型RNA酶活性區(qū)域，dsRNA結(jié)合區(qū)域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū)si

19、RNAslong dsRNA一種小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer加工而成。SiRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默，是RNAi的主要效應(yīng)分子 Small interfering RNA (siRNA)LOGOSmall interfering RNA (siRNA)：siRNA有如下特點(diǎn)：有如下特點(diǎn)：1. 長度約在長度約在22nt左右。左右。2. 依賴依賴Dicer酶的加工，是酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。產(chǎn)物的特點(diǎn)。3. 生成需要生成需要Argonaute家族蛋白存在。家族蛋白存在。4. 是是RISC組分

20、。組分。5. siRNA合成是由雙鏈的合成是由雙鏈的RNA或或RNA前體形成的。前體形成的。6. siRNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間干涉的中間產(chǎn)物。產(chǎn)物。7. 結(jié)構(gòu)上，結(jié)構(gòu)上， siRNA是雙鏈?zhǔn)请p鏈RNA。8. 在在Dicer酶的加工過程中，酶的加工過程中， siRNA對(duì)稱地來源于雙鏈對(duì)稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩的前體的兩側(cè)臂。側(cè)臂。9. 在作用位置上，在作用位置上， siRNA可作用于可作用于mRNA的任何部位。的任何部位。10. 在作用方式上，在作用方式上， siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)只能

21、導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控?？亍?1. siRNA不參與生物生長，是不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。性和病毒感染。LOGO走進(jìn)走進(jìn)MicroRNA的大世界的大世界 MicroRNA也可以也可以寫做寫做miRNA ，是，是一種一種2125nt長長的單鏈小分子的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核它廣泛存在于真核生物中，是一組不生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序編碼蛋白質(zhì)的短序列列RNA。成熟的。成熟的miRNA，5端有端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，一個(gè)磷酸基團(tuán)，3端為羥基。端為羥基。MicroRNAs: Expanding Fami

22、ly of RiboRegulators 其堿基分子能夠與那些和它的序列互補(bǔ)的mRNA分子相結(jié)合，有時(shí)候甚至可以與特定的DNA片斷結(jié)合。這種結(jié)合的結(jié)果就是導(dǎo)致基因的沉默。這種方式是身體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個(gè)重要策略。據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。LOGOMiRNA的作用方式的作用方式 v 以線蟲以線蟲lin-4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯，但是不影響互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯，但是不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種的穩(wěn)定性，這種mRNA是目前發(fā)現(xiàn)的最多的種是目前發(fā)現(xiàn)的最多的種類。類。v 以擬南芥以擬南芥miR-171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因

23、為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式與完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式與siRNA相似，最后相似，最后切割靶切割靶mRNA。v 具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶基因完全結(jié)合時(shí)具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶基因完全結(jié)合時(shí)，切割，切割mRNA，不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)作，不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)作用。用。LOGOmiRNA與近親與近親siRNA的差異的差異 在描述兩者的差異之前，有必要先說一說它們的共同點(diǎn)：在描述兩者的差異之前，有必要先說一說它們的共同點(diǎn)：v 1 MiRNA和和siRNA都是由都是由22個(gè)左右的核苷組成；個(gè)左右的核苷組成；v 2 它們都是它們都是Dicer酶的產(chǎn)物；酶的產(chǎn)物；v 3 它們

24、在起干擾、調(diào)節(jié)作用時(shí)都會(huì)和它們?cè)谄鸶蓴_、調(diào)節(jié)作用時(shí)都會(huì)和RISC誘導(dǎo)的沉默誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合；結(jié)合；v 4 它們都可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平干擾以抑制靶標(biāo)基因的翻譯；它們都可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平干擾以抑制靶標(biāo)基因的翻譯；LOGOLOGO RNA干擾的分子機(jī)制干擾的分子機(jī)制: 關(guān)于這個(gè)問題，目前闡明的并不是很清楚，關(guān)于這個(gè)問題，目前闡明的并不是很清楚，其中很多問題都還沒有解決，但是大體模型其中很多問題都還沒有解決，但是大體模型已經(jīng)建立。已經(jīng)建立。How does RNAi work?RNAi works postrans

25、criptionally.in key two steps!processing the dsRNA into 21-23 nt fragments3427212016short-interfering RNAQ ui ckTi m e?and aG IF decom pressorare needed to see thi s pi cture.step one: Tuschl, 2001第一步（起始階段）第一步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被RNase樣的特異核酸酶切割加工成2123nt的由正義和反義鏈組成的小干擾小干擾RNA（small interfering RNA，si

26、RNA）。siRNAs have a defined structure19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNA的兩條單鏈末端為5-磷酸和3-羥基，且3端均有2-3個(gè)突出的核苷酸。RNAi silencing complex may be associated with translating ribosomes active RNAse enzyme not yet identified may participate in endogenous pathways that silence genes via translational repression 第二步

27、（效應(yīng)階段）第二步（效應(yīng)階段）是siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。Tuschl, 2002the antisense strand of the siRNA guides cleavagestep two: 活化的RISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對(duì)應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。Gisela Storz, Science,

28、 296(5571):1263-1265, 2002. 擴(kuò)增和擴(kuò)散階段擴(kuò)增和擴(kuò)散階段siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被dicer切割、降解而生成大量的次級(jí)次級(jí)siRNA。次級(jí)siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；RNAi具有很高的特異性；只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi；只有針對(duì)編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；RNAi抑制基因表達(dá)

29、具有很高的效率，可達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對(duì)很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的；二、二、RNARNA干擾的機(jī)制干擾的機(jī)制 RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：二、二、RNARNA干擾的機(jī)制干擾的機(jī)制 RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號(hào)甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳給F1，但F2往往恢復(fù)為野生型。dsRNA不得短于不得短于21個(gè)堿基，大于個(gè)堿基，大于30 bp的的dsRNA不能在哺不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因

30、表達(dá)受抑和凋亡；基因表達(dá)受抑和凋亡； RNAi作用迅速，mRNA快速降解； RNAi效應(yīng)的依賴性，只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。RNAi干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征：Mammals exhibit potent responses to dsRNAPKRPPPeiF2a adsRNABlockage of protein synthesisinterferonproductioncell deathapoptosisdsRNA 進(jìn)入哺乳動(dòng)物成體細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)病毒防御機(jī)制被激活。細(xì)胞內(nèi)干擾素產(chǎn)生增加，蛋白激酶PKR激活，使轉(zhuǎn)錄

31、因子E2F被抑制，非特異性的阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。smaller RNAs can escape the PKR pathwaysiRNAs are not recognized by the PKR!recall that siRNAs are intermediate effectorsIn the RNAi pathwayRNAi調(diào)控染色質(zhì)甲基化 RNA干擾的一部分作用機(jī)理：由于只有在DNA未折疊的情況下基因才會(huì)表現(xiàn)，因此RNAi憑借甲基化等修飾組蛋白而影響局部DNA的折疊，從調(diào)控大區(qū)域的基因表現(xiàn)，在發(fā)育及分化的過程中扮演了極為重要的地位。而且RNAi所誘發(fā)的染色質(zhì)修飾需要RN

32、A polymeraseII的參與，而也就說明了這種憑借甲基化染色質(zhì)來抑制基因表達(dá)的過程，可能也是需要先轉(zhuǎn)錄成RNA，然后制造siRNA以進(jìn)行染色質(zhì)的修飾，抑制基因的表達(dá)。siRNA and Silent Chromatin - Model RNA homologous to centromeric repeats are processed siRNAssiRNAs may recruit Clr4 histone H3 methylase result in meth. of H3 Lys9Swi6 binds chromatin Gene silencing 總之,作為一門新興的技術(shù)，R

33、NA干擾中還有很多的細(xì)節(jié)沒有弄清楚，比如RNA干擾的所有中介物是什么，不同RISC是如何形成的。但是這并不妨礙我們對(duì)于它的應(yīng)用前景的展望。RNARNA干擾的應(yīng)用及前景干擾的應(yīng)用及前景1、基因功能的研究2、病毒性疾病的治療3、腫瘤的治療4、藥物的研發(fā)1.基因功能研究基因功能研究由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除

34、技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢(shì)，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療艾滋病艾滋病 Jacque et al 針對(duì)HIV-1復(fù)制的早期和晚期, 設(shè)計(jì)針對(duì)HIV-1基因組不同區(qū)域的siRNAs, 并轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞系、原始淋巴細(xì)胞及CD4+HeLa細(xì)胞, 結(jié)果證明RNAi能夠降低HIV-1基因組的RNA.Nature 2002Introduced 22 nucleotide synthetic siRNAs (complementary to HIV target +/- GF

35、P) into human cell lines/ primary lymphocytes RESULTS: DO NOT ACTIVATE PKR PATHWAYand siRNAs SPECIFICALLY DEGRADE HIV-1 mRNA, dsRNA-activated protein kinase2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療HBV Shlomai et al 針對(duì)HBV的核心抗原開放閱讀框和X蛋白開放閱讀框設(shè)計(jì)了兩個(gè)siRNA片段, 有效地抑制了Huh-7細(xì)胞系中HBV的復(fù)制.Hepatology 2003Kapadia et al 利用RNAi技術(shù), 對(duì)HCV進(jìn)行研究,

36、 用針對(duì)HCV的2個(gè)RNAi與表達(dá)HCV的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的肝癌細(xì)胞株Huh-7細(xì)胞, 2 d后, Northern雜交檢測HCV的RNA含量降低, 證明HCV特異的siRNA抑制了病毒的復(fù)制.Proc Natl Acad Sci USA 20032.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療_HCV科學(xué)家已經(jīng)用RNAi研究過如：人流感病毒、柯薩奇病毒B3 (CVB3)、人多瘤病毒JCV等病毒。siRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒防御與治療。 2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療_其它病毒其它病毒 用R

37、NAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。(1)RNAi可應(yīng)用于敲除點(diǎn)突變激活的癌基因，(2)RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達(dá)，(3)RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴(kuò)增。3.腫瘤治療腫瘤治療 在藥物開發(fā)過程中，用RNAi技術(shù)可以對(duì)靶基因的功能進(jìn)行分析，有助于搞清藥物的作用機(jī)制以及與基因編碼產(chǎn)物，及與相應(yīng)化合物的相互作用，從而更正確地發(fā)現(xiàn)藥靶，開發(fā)更有效的候選藥物。4.藥物開發(fā)藥物開發(fā) 總之, RNAi作為偶然發(fā)現(xiàn)的一種生物體的自然現(xiàn)象, 發(fā)現(xiàn)者本身可能并沒有預(yù)料到其應(yīng)用前景及潛在的價(jià)值, 但隨著眾多的

38、研究人員的加入, 一個(gè)具有劃時(shí)代意義的技術(shù)將有望使人類擺脫疾病的困擾.siRNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. siRNA的設(shè)計(jì)2. siRNA的制備 3. siRNA的轉(zhuǎn)染 (一)siRNA的設(shè)計(jì)(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。 (2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列同源的序列。 (3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 (1)RNAi目標(biāo)序列的選取原則 siRNA的設(shè)計(jì) (2)陰性對(duì)照 一

39、個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。 (二)siRNA的制備 在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究中，由于利用較長的雙鏈就可以誘導(dǎo)RNAi而無須合成siRNA，因此設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)的步驟比較簡便。只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄就可得到所需要的dsRNA，再通過浸泡、注射或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞即可。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長的dsRNA(多于29個(gè)核苷酸)會(huì)導(dǎo)致非特異基因沉默，只有21個(gè)核苷酸大小的siRNA才能有效引發(fā)特異的基因沉默

40、，所以RNAi的設(shè)計(jì)與非哺乳動(dòng)物的有所不同。目前制備siRNA的方法主要有兩類，即體外制備和體內(nèi)表達(dá)，兩者最大的不同在于：前者直接作用于RNA，而后者的對(duì)象則是DNA。根據(jù)具體工具不同可進(jìn)一步劃分為5種RNAi實(shí)驗(yàn)方法。 siRNA的制備體外轉(zhuǎn)錄法siRNA表達(dá)載體化學(xué)合成法制備siRNA 的混合物siRNA表達(dá)盒子siRNA的制備 化學(xué)合成法這種方法比任何其他方法都要昂貴，但是化學(xué)合成siRNA幾乎不需要研究者的操作。應(yīng)遵循以下步驟：(1)掃描靶基因中的序列，記錄每個(gè)3 端19個(gè)核苷酸作為可能的siRNA靶位點(diǎn)；(2)篩選GC含量較低的序列；(3)可能的序列要經(jīng)適合的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分

41、析，去除那些與其它基因明顯同源的序列(推薦使用NCBI的BLAST)；(4)最后得到長度為21個(gè)堿基的序列，從中選擇24條進(jìn)行測試。除了實(shí)驗(yàn)成本過高以外，化學(xué)合成的另一個(gè)缺點(diǎn)就是周期較長。siRNA的制備 體外轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄法同樣是體外制備siRNA，它要經(jīng)濟(jì)、快速許多，因?yàn)樾枰瘜W(xué)合成的是DNA。體外轉(zhuǎn)錄合成的程序是，在設(shè)計(jì)好siRNA 序列后，先合成兩條長度為29個(gè)堿基的DNA序列模板，其中包括5 端與T7啟動(dòng)子引物3 端互補(bǔ)的堿基(稱引導(dǎo)序列)，及下游編碼選定的siRNA 的正義鏈或反義鏈的基因序列。然后將兩條DNA模板與T7啟動(dòng)子引物退火結(jié)合，用DNA 聚合酶Klenow 合成dsDN

42、A模板，再分別用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。最后將得到的產(chǎn)物經(jīng)過單鏈專一的核酸酶消化，去除5 末端的引導(dǎo)序列，隨即得到需要的21個(gè)核苷酸的雙鏈siRNA。經(jīng)純化后將其轉(zhuǎn)入特定的載體中，轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞就可以誘導(dǎo)目的基因沉默。另外也可用此法轉(zhuǎn)錄出長度為4550個(gè)核苷酸的小發(fā)夾RNA ，它通過載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。shRNA 在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA，從而引發(fā)基因沉默。利用此法得到的siRNA 產(chǎn)量有限，不適合制備大量siRNA以進(jìn)行長期研究。 siRNA的制備 制備siRNA 的混合物該法克服了需要設(shè)計(jì)并測試許多siRNA序列的缺點(diǎn)。其原理是利用一種RNase 11酶消化dsRNA，用得到的

43、混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過程如下：(1)利用編碼目的mRNA的長度為2001000個(gè)堿基的DNA 作為轉(zhuǎn)錄模板，體外轉(zhuǎn)錄制備長的dsRNA；(2)在體外利用RNasem酶(或Dicer)消化長的dsRNA，產(chǎn)生siRNA的混合物；(3)純化混合物，除去未消化的dsRNA。存在誘發(fā)非特異性基因沉默的可能。siRNA的制備 siRNA表達(dá)載體siRNA表達(dá)載體的特點(diǎn)是包含1種RNA聚合酶啟動(dòng)子(polm)以啟動(dòng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，另外還有45個(gè)T的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。常用RNA聚合酶啟動(dòng)子包括人和鼠的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子等3種。操作過程為：首先訂購兩條編碼目的小發(fā)卡siRNA 的寡聚DNA，經(jīng)退火后克隆入所選載體的

44、pol llI啟動(dòng)子下游。轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，載體就能表達(dá)shRNA，隨后被加工成siRNA，引發(fā)基因沉默。由于涉及到克隆，且要對(duì)載體中包含嵌入物的區(qū)域進(jìn)行測序，所以制備時(shí)間較長。而且質(zhì)粒在某些不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率較低。siRNA的制備 siRNA表達(dá)盒子siRNA表達(dá)盒子(SECs)是PCR引發(fā)的siRNA表達(dá)模板，與表達(dá)載體不同，它無需首先克隆入載體。SECs依次包含RNA 聚合酶啟動(dòng)子、編碼小發(fā)卡RNA 的模板DNA 序列和RNA 聚合酶終止位點(diǎn)。只要將插入EcoR I和HindllI限制性位點(diǎn)的RNA 聚合酶啟動(dòng)子和終止子的PCR引物，與合成好的模板DNA 序列在體外進(jìn)行PCR擴(kuò)增

45、，即可得到大量SECs。將PCR擴(kuò)增后的SECs插入表達(dá)載體中，直接轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以在體內(nèi)引發(fā)功能性的siRNA 的表達(dá)，從而介導(dǎo)目的基因抑制。SECs不像siRNA那樣易于轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。另外，如果不克隆入質(zhì)粒，SECs不易擴(kuò)增?；瘜W(xué)學(xué)合成合成體外體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄混合物混合物表表達(dá)載達(dá)載體體制制備時(shí)間備時(shí)間成本估成本估計(jì)計(jì)序列序列測試測試轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效果染效果siRNA的制備方法比較表達(dá)盒子表達(dá)盒子最佳最佳選擇選擇4天至2周1至2天1至2天2至3周1天最高適中低適中適中需要需要不需要需要需要好好好一般一般確定最佳和高純度序列篩選測試序列快速、低成本長周期研究篩選序列(三)siRNA的轉(zhuǎn)染1.磷酸

46、鈣共沉淀 2.電穿孔法 3. DEAE-葡聚糖和polybrene 4.機(jī)械法機(jī)械法 將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種： 5.陽離子脂質(zhì)體試劑陽離子脂質(zhì)體試劑siRNA的轉(zhuǎn)染 磷酸鈣共沉淀 將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。 siRNA的轉(zhuǎn)染 電穿孔法 電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致

47、細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。 siRNA的轉(zhuǎn)染 DEAE-葡聚糖和polybrene 帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子結(jié)合使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。siRNA的轉(zhuǎn)染 機(jī)械法 轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂?/p>

48、高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。 siRNA的轉(zhuǎn)染 陽離子脂質(zhì)體試劑 在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。 siRNA的轉(zhuǎn)染1.純化siRNA 2.避免RNA酶污染 3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確

49、保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性 4.避免使用抗生素避免使用抗生素 為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，需要注意以下幾點(diǎn)：siRNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. siRNA的設(shè)計(jì)2. siRNA的制備 3. siRNA的轉(zhuǎn)染 (一)siRNA的設(shè)計(jì)(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。 (2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列同源的序列。 (3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 (1)RNAi目標(biāo)序列的選取原則

50、 siRNA的設(shè)計(jì) (2)陰性對(duì)照 一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。 (二)siRNA的制備 在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究中，由于利用較長的雙鏈就可以誘導(dǎo)RNAi而無須合成siRNA，因此設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)的步驟比較簡便。只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄就可得到所需要的dsRNA，再通過浸泡、注射或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞即可。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長的dsRNA(多于29個(gè)核苷酸)會(huì)導(dǎo)致非特異基因沉默，只有21個(gè)核苷酸大小

51、的siRNA才能有效引發(fā)特異的基因沉默，所以RNAi的設(shè)計(jì)與非哺乳動(dòng)物的有所不同。目前制備siRNA的方法主要有兩類，即體外制備和體內(nèi)表達(dá)，兩者最大的不同在于：前者直接作用于RNA，而后者的對(duì)象則是DNA。根據(jù)具體工具不同可進(jìn)一步劃分為5種RNAi實(shí)驗(yàn)方法。 siRNA的制備體外轉(zhuǎn)錄法siRNA表達(dá)載體化學(xué)合成法制備siRNA 的混合物siRNA表達(dá)盒子siRNA的制備 化學(xué)合成法這種方法比任何其他方法都要昂貴，但是化學(xué)合成siRNA幾乎不需要研究者的操作。應(yīng)遵循以下步驟：(1)掃描靶基因中的序列，記錄每個(gè)3 端19個(gè)核苷酸作為可能的siRNA靶位點(diǎn)；(2)篩選GC含量較低的序列；(3)可能的

52、序列要經(jīng)適合的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，去除那些與其它基因明顯同源的序列(推薦使用NCBI的BLAST)；(4)最后得到長度為21個(gè)堿基的序列，從中選擇24條進(jìn)行測試。除了實(shí)驗(yàn)成本過高以外，化學(xué)合成的另一個(gè)缺點(diǎn)就是周期較長。siRNA的制備 體外轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄法同樣是體外制備siRNA，它要經(jīng)濟(jì)、快速許多，因?yàn)樾枰瘜W(xué)合成的是DNA。體外轉(zhuǎn)錄合成的程序是，在設(shè)計(jì)好siRNA 序列后，先合成兩條長度為29個(gè)堿基的DNA序列模板，其中包括5 端與T7啟動(dòng)子引物3 端互補(bǔ)的堿基(稱引導(dǎo)序列)，及下游編碼選定的siRNA 的正義鏈或反義鏈的基因序列。然后將兩條DNA模板與T7啟動(dòng)子引物退火結(jié)合，用D

53、NA 聚合酶Klenow 合成dsDNA模板，再分別用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。最后將得到的產(chǎn)物經(jīng)過單鏈專一的核酸酶消化，去除5 末端的引導(dǎo)序列，隨即得到需要的21個(gè)核苷酸的雙鏈siRNA。經(jīng)純化后將其轉(zhuǎn)入特定的載體中，轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞就可以誘導(dǎo)目的基因沉默。另外也可用此法轉(zhuǎn)錄出長度為4550個(gè)核苷酸的小發(fā)夾RNA ，它通過載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。shRNA 在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA，從而引發(fā)基因沉默。利用此法得到的siRNA 產(chǎn)量有限，不適合制備大量siRNA以進(jìn)行長期研究。 siRNA的制備 制備siRNA 的混合物該法克服了需要設(shè)計(jì)并測試許多siRNA序列的缺點(diǎn)。其原理是利用一種RNase 11酶消化dsRNA，用得到的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過程如下：(1)利用編碼目的mRNA的長度為2001000個(gè)堿基的DNA 作為轉(zhuǎn)錄模板，體外轉(zhuǎn)錄制備長的dsRNA；(2)在體外利用RNasem酶(或Dicer)消化長的dsRNA，產(chǎn)生siRNA的混合物；(3)