第十九章補(bǔ)體檢測及應(yīng)用

1、精選ppt 第十九章第十九章 補(bǔ)體檢測及應(yīng)用補(bǔ)體檢測及應(yīng)用精選ppt第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、補(bǔ)體的性質(zhì)一、補(bǔ)體的性質(zhì)精選ppt1 1、補(bǔ)體的概念與來源、補(bǔ)體的概念與來源n 補(bǔ)體（complement，C）又稱補(bǔ)體系統(tǒng)，是一組存在于人和脊椎動物血清與組織液中具有酶樣活性、不耐熱和功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白，包括30余種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白,是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補(bǔ)充條件。n體內(nèi)多種組織細(xì)胞均能合成補(bǔ)體成分，其中肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是補(bǔ)體的主要產(chǎn)生細(xì)胞。精選ppt2、補(bǔ)體系統(tǒng)的組成n補(bǔ)體并非單一成分，是由30余種活性成分組成的補(bǔ)體系統(tǒng)，是體內(nèi)最復(fù)雜的一個(gè)限制性蛋白酶解系統(tǒng)（limited pro

2、teolysis system）。n按其生物學(xué)功能分為三類：精選ppt1、補(bǔ)體系統(tǒng)的固有成分：指存在于體液中參與補(bǔ)體激活過程的補(bǔ)體成分。經(jīng)典激活途徑： C1q、C1r、C1s、C4、C2；甘露聚糖結(jié)合凝集素激活途徑：MBL、絲氨酸蛋酶；旁路激活途徑：B因子、P因子、D因子；共同末端通路：C3、C5、C6、C7、C8、C9。精選ppt2、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白：指參與調(diào)控補(bǔ)體活化的抑制因子或滅活因子，多以其功能命名。 C1抑制物（C1 inhibitor，C1INH）、C4結(jié)合蛋白（C4BP）、I因子、H因子、S蛋白和膜協(xié)同因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）。3、補(bǔ)體受

3、體（complement receptor，CR）：指介導(dǎo)補(bǔ)體活性片段或調(diào)節(jié)蛋白生物學(xué)效應(yīng)的各種受體，以其結(jié)合對象來命名，如C1rR 、C5aR/C3aR、C1qR，對C3片段的受體則用CR1-CR5表示，調(diào)節(jié)蛋白的受體。精選ppt3、補(bǔ)體系統(tǒng)的命名原則n參與補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的固有成分,按其被發(fā)現(xiàn)的先后分別命名為:C1(q、r、s)、C2、C9；補(bǔ)體系統(tǒng)的其他成分則以因子命名，用英文大寫字母表示：如B因子、D因子、P因子；n補(bǔ)體活化后的裂解片段以該成分的符號后加小寫英文字母表示，通常a為小片段，b為大片段，但C2a為大片段，C2b為小片段;精選pptn具有酶活性的成分或復(fù)合物在其字符上畫一橫線

4、表示，如 等；n滅活的補(bǔ)體片段在其字符前加英文字母i表示，如失活的C3b稱為iC3b;n補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白多以其功能命名：C1抑制物、C4結(jié)合蛋白等。bBbC3精選ppt4、補(bǔ)體的性質(zhì)n補(bǔ)體大多為糖蛋白，其中C1q分子量最大，D因子最??；n血清蛋白電泳中，補(bǔ)體大多位于球蛋白區(qū)，少數(shù)位于 或球蛋白區(qū)，如C1q、C8等為球蛋白，C1s、C9為球蛋白。精選pptn正常血清中補(bǔ)體含量相對穩(wěn)定，補(bǔ)體蛋白約占總蛋白量的10%左右，補(bǔ)體各組分含量相差較大，其中C3含量最高，達(dá)1-2mg/ml，Df最低。n補(bǔ)體的性質(zhì)不穩(wěn)定，較其他蛋白質(zhì)對理化因素更為敏感，加熱、紫外線照射、機(jī)械振蕩、酸堿和酒精等因素均可破壞補(bǔ)體。精

5、選pptn在010 補(bǔ)體活性保持3-4天， -20 以下冷凍或真空干燥可使其活性保持較長時(shí)間，標(biāo)本保存應(yīng)置于-20 以下。n補(bǔ)體滅活：加熱5630min可使血清中絕大部分補(bǔ)體失去活性，故補(bǔ)體活性檢測應(yīng)盡快進(jìn)行。n補(bǔ)體代謝主要在血液和肝臟中進(jìn)行，代謝率快，每天約更新一半。n各種屬動物間血中補(bǔ)體含量不同，豚鼠血清中含量豐富，故實(shí)驗(yàn)室多采用豚鼠血清作為補(bǔ)體來源。 精選ppt補(bǔ)體補(bǔ)體成分成分分子量分子量電泳電泳區(qū)帶區(qū)帶血清含量參考值血清含量參考值（g/ml）補(bǔ)體補(bǔ)體 成分成分分子量分子量電泳電泳區(qū)帶區(qū)帶血清含量參考值血清含量參考值（g/ml）C1q390270C979240C1r9535B952102

6、40C1s8535D252C211712030P220225C319011300C1INH150180C41802430600C4bp1100250C5190275I因子因子9350C6128260H因子因子159400480C7120255S因子因子88500C81631200精選ppt 二、補(bǔ)體的活化途徑n生理情況下，血清中大多數(shù)補(bǔ)體蛋白以酶原形式存在于體液中，一旦被活化物質(zhì)激活，補(bǔ)體各組分便產(chǎn)生連鎖酶促反應(yīng)即級聯(lián)（cascade）反應(yīng)，表現(xiàn)出相應(yīng)的生物活性。精選pptn補(bǔ)體的激活途徑按起始順序不同分為三種：n經(jīng)典途徑（classical complement pathway）：抗原抗體復(fù)

7、合物結(jié)合C1q啟動激活的途徑；是抗體介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)形式；精選pptn替代途徑（alternative complement pathway）：病原微生物等提供結(jié)合表面，不經(jīng)C1、C4、C2的參與，在B因子、D因子、P因子的參與下直接從激活C3開始的途徑，是在感染早期，最先發(fā)揮作用的途徑；經(jīng)典途徑的激活可以導(dǎo)致替代途徑的活化，反之則不行。精選pptn甘露聚糖結(jié)合凝集 素 （ m a n n a n binding tectin，MBL）途徑，簡稱MBL途徑：MBL結(jié)合至細(xì)菌而啟動激活的途徑，此途徑不依賴于抗原抗體復(fù)合物的形成，在感染的早期就能發(fā)揮免疫防御效應(yīng)，為急性期蛋白途徑。精選

8、ppt1、補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑n主要激活物：IgG3、 IgG1 、IgG2和IgM類抗體與相應(yīng)抗原形成的免疫復(fù)合物。此外還發(fā)現(xiàn)有許多因子可以激活此途徑，如細(xì)菌脂多糖、dsDNA、C-反應(yīng)蛋白和心肌線粒體等。精選pptn始動環(huán)節(jié)：C1q與IC中抗體分子的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。IgG分子必須要兩個(gè)或以上，而IgM一個(gè)分子 即可激活C1q。精選pptn激活過程：補(bǔ)體C1-C9共11種成分全部參與的活化途徑。經(jīng)典途徑的活化過程可分為識別、活化和膜攻擊三個(gè)階段。n識別階段：C1q識別免疫復(fù)合物至C1酯酶形成（小片段C1s）。n活化階段：活化的C1s依次裂解C4和C2，形成具有酶活性的C3轉(zhuǎn)化酶（ ）和C5

9、轉(zhuǎn)化酶（ ）的過程。bbC24bbbC324精選ppt經(jīng)典途徑經(jīng)典途徑精選ppt2、補(bǔ)體激活的替代途徑n替代途徑的激活劑：某些細(xì)菌、革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素、細(xì)菌的脂多糖、肽聚糖、葡聚糖、酵母多糖、凝聚的IgG4和IgA聚合物等。精選pptn激活過程：C3是啟動替代途徑并參與其后級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子。n 經(jīng)典途徑產(chǎn)生或自發(fā)產(chǎn)生的C3b與B因子結(jié)合，血清D因子的作用，形成C3轉(zhuǎn)化酶（ ）， 不穩(wěn)定，與血清P因子結(jié)合則形成穩(wěn)定的C3轉(zhuǎn)化酶（ ）； C3轉(zhuǎn)化酶水解C3，形成C5轉(zhuǎn)化酶（ 或 ）；bBbC3bnBbPC3bBbPC3bnBbC3精選pptn激活的特點(diǎn)：n可以識別自己與非己：C3b的中止與激活

10、n替代途徑是補(bǔ)全權(quán)系統(tǒng)重要的放大機(jī)制：替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶對經(jīng)典途徑補(bǔ)體的活化是一種放大機(jī)制。精選ppt3、MBL途徑n激活物：病原微生物感染所誘導(dǎo)產(chǎn)生的急性期蛋白，如MBL、CRP等。n激活過程：MBL與細(xì)菌的甘露糖殘基結(jié)合；再與絲氨酸蛋白酶結(jié)合，形成MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶（MASP-1、MASP-2），MASP具有與活化的C1q同樣的生物學(xué)活性，可水解C4和C2，形成C3轉(zhuǎn)化酶；其后過程與經(jīng)典途徑相同。n激活特點(diǎn)：MBL途徑開始于急性期蛋白與病原體的結(jié)合，而不是抗原抗體復(fù)合物形成。精選ppt4、共同末端效應(yīng)nC5轉(zhuǎn)化酶裂解C5是補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中最后一個(gè)酶促步驟。n若補(bǔ)體激活發(fā)生在脂質(zhì)雙層上，

11、則形成MAC；n若補(bǔ)體激活發(fā)生在沒有靶細(xì)胞的血清中則有關(guān)補(bǔ)體成分可同S蛋白形成親水的無溶細(xì)胞活性的SC5b7、 SC5b8及SC5b9。6、三種激活途徑的比較精選ppt5、三種激活途徑的示意圖精選ppt經(jīng)典激活途徑經(jīng)典激活途徑替代激活途徑替代激活途徑MBLMBL途徑途徑激活物質(zhì)激活物質(zhì)抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBLMBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶起始分子起始分子C1qC1qC3C3C2C2、C4C4參與補(bǔ)體成分參與補(bǔ)體成分C1C1、C4C4、C2C2、C3C3、C5-C5-C9C9C3C3、C5-C9C5-C9、B B因子、因子、D

12、 D因子因子C2-C9C2-C9、 MASPMASP所需離子所需離子CaCa2+2+、MgMg2+2+MgMg2+2+CaCa2+2+C3C3轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBbC4b2bC4b2bC5C5轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbC3bnBbC4b2b3bC4b2b3b生物學(xué)作用生物學(xué)作用參與特異性免疫的參與特異性免疫的效應(yīng)階段效應(yīng)階段, ,感染后期感染后期發(fā)揮作用發(fā)揮作用參與非特異性免疫的參與非特異性免疫的效應(yīng)階段效應(yīng)階段, ,感染早期感染早期發(fā)揮作用發(fā)揮作用參與非特異性免疫的參與非特異性免疫的效應(yīng)階段效應(yīng)階段, ,感染早期感染早期發(fā)揮作用發(fā)揮作用

13、6、精選ppt7、補(bǔ)體激活的調(diào)控n機(jī)體必須有嚴(yán)密的補(bǔ)體調(diào)控機(jī)制。正常生理情況下補(bǔ)體激活是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng),失控的補(bǔ)體激活反應(yīng)可使大量補(bǔ)體無益消耗、產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng)以及造成機(jī)體自身組織細(xì)胞的病理性損傷。n補(bǔ)體的調(diào)控方式：補(bǔ)體成分的自身衰變和各種補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的作用。精選pptn自身衰變的調(diào)節(jié):被激活后的補(bǔ)體蛋白往往不穩(wěn)定。n補(bǔ)體裂解片段C4b、C3B、C5b呈游離狀態(tài)時(shí)會迅速衰變,須與細(xì)胞膜結(jié)合才能產(chǎn)生補(bǔ)體的級聯(lián)反應(yīng);nC3轉(zhuǎn)化酶和C5轉(zhuǎn)化酶亦極易衰變,從而限制后續(xù)補(bǔ)體成分的酶 促激活反應(yīng);n與細(xì)胞膜結(jié)合的C5也可自行衰變,使MAC無法大量形成。精選pptn調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)：n補(bǔ)體激活啟動階段

14、的調(diào)節(jié)；n對單一補(bǔ)體蛋白轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié)；n對MAC形成的調(diào)節(jié)；n某些細(xì)胞表面存在的補(bǔ)體受體分子也參與補(bǔ)體活化的調(diào)節(jié)。精選pptnC1抑制物（C1INH）：以共價(jià)結(jié)合C1r、C1s，防止C1的自發(fā)激活，亦可使C1酯酶失去裂解C4和C2的能力。nC4結(jié)合蛋白（C4bp）：n競爭性抑制C4b與C2的結(jié)合，阻止C3轉(zhuǎn)化酶的形成；n促進(jìn) 分解，從中置換出C2b使C3轉(zhuǎn)化酶失活；n輔助I因子裂解游離的C4b。bbC24精選pptnH因子：n競爭性抑制B因子與C3b的結(jié)合，阻止C3轉(zhuǎn)化酶的形成n促進(jìn)I因子滅活C3bnI因子：在C4bp和H因子的協(xié)同作用下可使C4b和C3b裂解。nS蛋白：與C5b67結(jié)合，阻止

15、其插入細(xì)胞脂膜而抑制MAC形成。精選pptn同種限制因子（HRF）：與C8蛋白結(jié)合而干擾C9和C8相結(jié)合，使自身細(xì)胞膜上不能形成MAC。n衰變加速因子（DAF）：n競爭性抑制B因子與C3b的結(jié)合，阻止C3轉(zhuǎn)化酶的形成；n促進(jìn) 分解，從中置換出C2b使C3轉(zhuǎn)化酶失活；bbC24精選ppt三、補(bǔ)體的生物學(xué)功能三、補(bǔ)體的生物學(xué)功能n補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)作用分為兩大類：n補(bǔ)體在細(xì)胞膜表面激活并形成MAC，介導(dǎo)細(xì)胞溶解；n補(bǔ)體裂解片段介導(dǎo)的各種生物學(xué)效應(yīng)。n補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)功能：n補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用精選pptn調(diào)理吞噬和免疫粘附作用：是機(jī)體抗感染的主要防御機(jī)制。n補(bǔ)體的調(diào)理吞噬：補(bǔ)體裂解片段C3b、C4

16、b、iC3b等可與細(xì)菌、病毒等顆粒性物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對其吞噬；n免疫粘附作用：C3b與病毒或IC等結(jié)合后，可介導(dǎo)后者與具有C3b受體的人RBC、PLT等結(jié)合，從而有利于吞噬細(xì)胞捕獲和清除。精選pptn炎癥介質(zhì)作用n過敏毒素作用：C5a、C3a、C4a與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，能使肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒n激肽樣作用：C2a、C4a可引起炎性滲出和水腫n趨化作用：C5a、C3aS可使N定向移動精選pptn清除免疫復(fù)合物作用n抑制IC的形成：空間位阻效應(yīng)n促進(jìn)IC的清除：C3b介導(dǎo)免疫粘附n免疫調(diào)節(jié)作用nC3可參與捕捉并固定抗原，通過與抗原提呈細(xì)胞上的CR1及CR2受體結(jié)合，使抗原易被A

17、PC處理和提呈n作用于多種免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化：C3b與B細(xì)胞表面CR1結(jié)合，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化n參與調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞效應(yīng)功能：NK結(jié)合C3b增強(qiáng)ADCC作用精選ppt第二節(jié)第二節(jié) 補(bǔ)體總活性測定補(bǔ)體總活性測定n補(bǔ)體總活性測定是對激活后補(bǔ)體最終效補(bǔ)體總活性測定是對激活后補(bǔ)體最終效應(yīng)的檢測方法，可借此反映補(bǔ)體的整體應(yīng)的檢測方法，可借此反映補(bǔ)體的整體功能。功能。n補(bǔ)體總活性測定方法是以紅細(xì)胞的溶解補(bǔ)體總活性測定方法是以紅細(xì)胞的溶解為指示，以為指示，以50%50%溶血為判斷終點(diǎn)，稱為溶血為判斷終點(diǎn)，稱為CH50CH50。精選pptn補(bǔ)體活化途徑不同，應(yīng)用不同的激活物補(bǔ)體活化途徑不同，應(yīng)用不同

18、的激活物可活化不同的補(bǔ)體途徑：可活化不同的補(bǔ)體途徑：n基于經(jīng)典途徑的基于經(jīng)典途徑的CP-CH50CP-CH50（臨床常規(guī)項(xiàng)目：（臨床常規(guī)項(xiàng)目：CH50CH50）n應(yīng)用于應(yīng)用于C3C3旁路檢測的旁路檢測的AP-CH50AP-CH50（尚未列入（尚未列入檢驗(yàn)常規(guī)）檢驗(yàn)常規(guī)）nMBLMBL途徑活性測定的可靠方法暫未建立途徑活性測定的可靠方法暫未建立精選ppt（一）CH50測定法的實(shí)驗(yàn)原理n補(bǔ)體最主要的活性是溶細(xì)胞作用。特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后可激活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細(xì)胞腫脹而發(fā)生溶血。精選pptn應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞（應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood s

19、heep red blood cell, SRBCcell, SRBC）和其相應(yīng)的抗體（溶血）和其相應(yīng)的抗體（溶血素），作為能誘導(dǎo)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑的素），作為能誘導(dǎo)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑的指示物和激活劑。補(bǔ)體能使溶血素特異指示物和激活劑。補(bǔ)體能使溶血素特異性結(jié)合的綿羊紅細(xì)胞溶解，當(dāng)溶血素和性結(jié)合的綿羊紅細(xì)胞溶解，當(dāng)溶血素和綿羊紅細(xì)胞濃度恒定時(shí)，溶血程度與補(bǔ)綿羊紅細(xì)胞濃度恒定時(shí)，溶血程度與補(bǔ)體含量和活性相關(guān)。將新鮮待檢血清作體含量和活性相關(guān)。將新鮮待檢血清作不同稀釋后，加入反應(yīng)體系，測定溶血不同稀釋后，加入反應(yīng)體系，測定溶血程度，以程度，以50%50%溶血時(shí)的最小血清用量作溶血時(shí)的最小血清用量作為判定

20、終點(diǎn)，可測知補(bǔ)體總?cè)苎钚浴榕卸ńK點(diǎn)，可測知補(bǔ)體總?cè)苎钚?。精選pptn補(bǔ)體溶血程度與補(bǔ)體的活性相關(guān)，但非直線關(guān)系。在一個(gè)適當(dāng)?shù)摹⒎€(wěn)定的反應(yīng)系統(tǒng)中，溶血反應(yīng)對補(bǔ)體的劑量依賴呈一特殊的S形曲線。n實(shí)驗(yàn)通常以50%溶血作為終點(diǎn)指標(biāo)，它比100%溶血更為敏感，這一方法稱為補(bǔ)體50%溶血實(shí)驗(yàn)（50% complement hemolysis），即CH50。精選pptnS形曲線: 以溶血百分率為縱坐標(biāo)，相應(yīng)血清量為橫坐標(biāo)，可見在輕微溶血和接近完全溶血時(shí)，對補(bǔ)體量的變化不敏感。在30%-70%之間最陡，幾乎呈直線，補(bǔ)體量的少許變動，也會造成溶血程度的較大改變，即曲線此階段對補(bǔ)體量的變化非常敏感。溶血程度

21、與補(bǔ)體含量的關(guān)系溶血程度與補(bǔ)體含量的關(guān)系 精選ppt 精選ppt（二）CH50試驗(yàn)方法 正式試驗(yàn)之前，應(yīng)：正式試驗(yàn)之前，應(yīng)：n調(diào)節(jié)制紅細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)制紅細(xì)胞濃度n滴定溶血素效價(jià)滴定溶血素效價(jià)精選ppt1、紅細(xì)胞濃度的調(diào)整n綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）自綿羊頸靜脈無菌采血，注入放有玻璃珠的無菌干燥三角燒瓶中，輕輕旋搖15min，除去纖維蛋白。也可將羊血與等量或2倍量的阿氏（Al-sever）液混合，既可抗凝，又適用于儲存。分裝，4保存，可用2-3周。精選pptn實(shí)驗(yàn)前，取適量SRBC用生理鹽水洗滌2次，第3次用緩沖液洗滌，離心棄上清液，取比積紅細(xì)胞用緩沖液配制S

22、RBC懸液，濃度一般為2%-5%。n為使每次試驗(yàn)時(shí)SRBC的濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可吸取少量紅細(xì)胞懸液，加入20-30倍的稀釋液中。在542nm波長處比濁，以吸光度為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整紅細(xì)胞濃度。精選ppt2、溶血素滴定n溶血素可通過溶血素可通過SRBCSRBC免疫家兔獲得，一般無需純化；免疫家兔獲得，一般無需純化；n試驗(yàn)前需先行加熱試驗(yàn)前需先行加熱56 30min56 30min或或60 3min60 3min以滅活以滅活補(bǔ)體；補(bǔ)體；n溶血素有商品銷售，可按標(biāo)識效價(jià)稀釋使用；溶血素有商品銷售，可按標(biāo)識效價(jià)稀釋使用；n自行制備的溶血素需進(jìn)行滴定，確定使用濃度，在自行制備的溶血素需進(jìn)行滴定，確定使用濃度，在補(bǔ)體活性

23、測定中，大多使用補(bǔ)體活性測定中，大多使用2 2個(gè)單位。個(gè)單位。n溶血素效價(jià)穩(wěn)定，一般使用溶血素效價(jià)穩(wěn)定，一般使用3 3個(gè)月后再作重新滴定個(gè)月后再作重新滴定精選pptn溶血素稀釋與滴定方法如下：n溶血素稀釋一般不用連續(xù)倍比稀釋法，這是因?yàn)橄♂尩阶詈罂缍忍?，不易確定單位。n置37溫育后觀察結(jié)果，以最高稀釋度的溶血素仍能產(chǎn)生完全溶血為最大的有效反應(yīng)管，即確定為1個(gè)單位（如1：4000）。n在補(bǔ)體活性測定或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中一般使用2U（即1：2000，試驗(yàn)時(shí)用1：1000的溶血素與2%SRBC等量混合致敏）。精選ppt3、稀釋緩沖液：n磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液等均可用于溶血試驗(yàn)，pH調(diào)到7.2-7.4

24、之間。n加適量NaCl以保持等滲；n加適量活化補(bǔ)體必不可少的Ca2+和Mg2+；n加入0.1%明膠以穩(wěn)定蛋白溶液；n加入0.02%NaN3防腐,以利保存。精選ppt4、50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管：n作CH50試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)同時(shí)配制50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。n方法：取2%綿羊紅細(xì)胞懸液0.5ml，加2.0ml蒸餾水，將SRBC全部溶解；再加入1.8%NaCl溶液2.0ml校正為等滲溶液；最后加入2%SRBC懸液0.5ml，即為50%溶血懸液；混勻后取此液2.5ml,隨試驗(yàn)一起溫育。精選ppt5、取新鮮血清標(biāo)本，按表CH50試驗(yàn)在各管中加入血清與試劑，一并置于37水浴箱中溫育30min。溫育后各管2500r/min離心

25、5min，仔細(xì)觀察比較，選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管最為相近的兩管，在分光光度計(jì)上分別讀取OD541值，以最接近標(biāo)準(zhǔn)管OD值的一管定為最高有效反應(yīng)管。n 50%50%溶血總補(bǔ)體值的計(jì)算：溶血總補(bǔ)體值的計(jì)算： CH50（U/ml）1/血清用量稀釋倍數(shù)n總補(bǔ)體活性參考范圍：50-100U/ml。精選ppt血清總補(bǔ)體50%溶血活性測定精選ppt（三）方法評價(jià)nCH50試驗(yàn)測定經(jīng)典途徑總補(bǔ)體溶血活性，所反應(yīng)的是補(bǔ)體9種成分的綜合水平；n方法簡便、快速，但敏感性較低；n影響因素多：實(shí)驗(yàn)時(shí)對反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)加控制，統(tǒng)一步驟。n補(bǔ)體的溶血活性與試驗(yàn)中反應(yīng)體積成反比；n與反應(yīng)所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、鈣鎂濃度、綿

26、羊紅細(xì)胞數(shù)量和反應(yīng)溫度有一定關(guān)系；n緩沖液pH和離子強(qiáng)度增高，補(bǔ)體活性下降；nCa2+、Mg2+可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但過量則反而抑制溶血反應(yīng)。精選ppt臨床意義nCH50CH50增高見于：增高見于： 急性炎癥、組織損急性炎癥、組織損傷、惡性腫瘤等；傷、惡性腫瘤等；nCH50CH50降低見于：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)降低見于：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎 、急性腎、急性腎小球腎炎等。小球腎炎等。精選ppt 一、概述n目前主要測定的補(bǔ)體成分： 根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）國際免疫學(xué)會報(bào)告，在30多種補(bǔ)體成分中，主要檢測C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物。n測定

27、方法可分為：溶血法和免疫化學(xué)法n溶血法：用以檢測單個(gè)補(bǔ)體成分的溶血活性；n免疫化學(xué)法：測定補(bǔ)體含量。n過去常采用單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或單向火箭免疫電泳n目前各檢測部門多采用免疫比濁法。隨著免疫檢測儀器的自動化、速率散射比濁法（rate nephelometry）應(yīng)用日益廣泛。本法可檢測包括C3、C4等補(bǔ)體成分在內(nèi)的20多種血漿中的特種蛋白，是一種快速、敏感和準(zhǔn)確的定量檢測方法。精選ppt第三節(jié)第三節(jié) 單個(gè)補(bǔ)體成分的測定單個(gè)補(bǔ)體成分的測定n常作為單個(gè)補(bǔ)體成分的檢測指標(biāo)：常作為單個(gè)補(bǔ)體成分的檢測指標(biāo)：C3C3、C4C4、C1qC1q、B B因子和因子和C1C1酯酶抑制物等；酯酶抑制物等；n測定方法：測

28、定方法： n免疫溶血法免疫溶血法 （檢測單個(gè)補(bǔ)體成分的活性）（檢測單個(gè)補(bǔ)體成分的活性）n免疫化學(xué)法（檢測單個(gè)補(bǔ)體成分的含量）免疫化學(xué)法（檢測單個(gè)補(bǔ)體成分的含量） 自動化免疫散射比濁法自動化免疫散射比濁法精選ppt一、免疫溶血法一、免疫溶血法 n 原理原理：主要根據(jù)抗原與其特異性抗體（IgG、IgM型）結(jié)合后可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，導(dǎo)致細(xì)胞溶解。n試驗(yàn)的指示系統(tǒng)試驗(yàn)的指示系統(tǒng)：該方法中抗原為SRBC，抗體為兔或馬抗SRBC的抗體，即溶血素。將兩者組合作為指示系統(tǒng)參與反應(yīng)。n參照體系參照體系: :以人為設(shè)計(jì)的缺乏某種補(bǔ)體成分的血清以人為設(shè)計(jì)的缺乏某種補(bǔ)體成分的血清為參照；為參照；精選ppt試驗(yàn)中參與

29、的兩組補(bǔ)體：n一組是作為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)的補(bǔ)體，選用或制備缺少待測成分的試劑（參照血清常稱之參照血清常稱之“R R（removeremove）”試劑試劑），加入致敏SRBC（檢測經(jīng)典途徑補(bǔ)體成分用）或總紅細(xì)胞RRBC（檢測替代途徑補(bǔ)體成分用）指示系統(tǒng)后，此時(shí)由于補(bǔ)體不能連續(xù)激活，不發(fā)生溶血。n選用先天缺乏某單一補(bǔ)體成分的動物或人血清，如某些人可天然缺乏C2、豚鼠缺C4、小鼠缺C5，家兔缺C6；n利用化學(xué)試劑人為滅活正常血清中某種成分制備缺乏該成分的補(bǔ)體試劑，如用氨或肼處理使豚鼠血清C4被破壞；用酵母多糖滅活C3等。n另一組為待測血清中的補(bǔ)體； 當(dāng)加入待測血清，使原來缺乏的成分得到補(bǔ)償，補(bǔ)體成分齊全

30、，級聯(lián)反應(yīng)恢復(fù)，產(chǎn)生溶血。溶血程度與待測補(bǔ)體成分活性有關(guān)，仍以50%溶血為終點(diǎn)。精選ppt方法學(xué)評價(jià)方法學(xué)評價(jià)n采用免疫溶血法檢測待測標(biāo)本中某一單個(gè)補(bǔ)體成分是否缺乏，可以幫助診斷補(bǔ)體某個(gè)成分缺失或其含量正常但無溶血活性的失天性補(bǔ)體缺陷。n無需特異儀器與設(shè)備，快速，但敏感性較低，影響因素多。n該法不是檢測某補(bǔ)體成分的具體含量，而是檢測其活性，在某些需了解該成分活性情況下，本試驗(yàn)適用。 n免疫溶血法常用于免疫溶血法常用于C2C2、C3C3、C4C4、C5C5、C6C6等補(bǔ)體成分的檢測。等補(bǔ)體成分的檢測。其中以其中以C3C3、C4C4兩成分的檢測更為常見。兩成分的檢測更為常見。精選ppt二、免疫化學(xué)

31、法二、免疫化學(xué)法n免疫化學(xué)法分類免疫化學(xué)法分類 n1.1.單向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散n2.2.火箭免疫電泳火箭免疫電泳n3.3.透射比濁法透射比濁法n4.4.散射比濁法散射比濁法n前兩種方法：手工操作繁瑣、耗時(shí)長、影響前兩種方法：手工操作繁瑣、耗時(shí)長、影響因素多、結(jié)果重復(fù)性差，已趨于淘汰因素多、結(jié)果重復(fù)性差，已趨于淘汰n后兩種方法：通過儀器對補(bǔ)體的后兩種方法：通過儀器對補(bǔ)體的C3C3、C4C4、B B因因子等單個(gè)成分進(jìn)行自動化測定子等單個(gè)成分進(jìn)行自動化測定 精選ppt方法評價(jià)：n手工免疫化學(xué)法：單向免疫擴(kuò)散法與火箭免疫電泳多用手工操作，影響因素多，結(jié)果重復(fù)性差，現(xiàn)已逐漸趨于淘汰；n自動免疫化學(xué)法

32、：散射、透射比濁法通過儀器對補(bǔ)體的C3、C4、B因子等單個(gè)成分進(jìn)行測定。待測血清標(biāo)本的C3、C4成分經(jīng)適當(dāng)稀釋后與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，反應(yīng)介質(zhì)中的PEG可使該復(fù)合物沉淀，儀器對復(fù)合物產(chǎn)生的光散射或透射信號進(jìn)行自動檢測，并換算成所測成分的濃度單位。檢測補(bǔ)體成分方法簡單、特異、重復(fù)性好、可反映所測補(bǔ)體成分的絕對值，并能夠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化流程管理，進(jìn)行質(zhì)量控制，是目前國內(nèi)外臨床免疫檢測中的主要檢測方法。 精選ppt第四節(jié)第四節(jié) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)n補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test，CFT）是經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)之一。凡能激活補(bǔ)體的IgM和IgG類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合

33、的反應(yīng)均可應(yīng)用本法檢測。n目前主要用于病毒性傳染病診斷和流行病學(xué)調(diào)查，以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原和HLA血清學(xué)分型的檢測。 精選ppt一、試驗(yàn)原理一、試驗(yàn)原理n試驗(yàn)的參與反應(yīng)的成分與系統(tǒng)（試驗(yàn)的參與反應(yīng)的成分與系統(tǒng)（ 5種成分，種成分，3個(gè)系個(gè)系統(tǒng)）統(tǒng)）：n反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）與待測抗體（或抗原）；n補(bǔ)體系統(tǒng)；n指示系統(tǒng)：SRBC與相應(yīng)溶血素，試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitized sheep red blood cell，SRBCS）。精選ppt試驗(yàn)的二個(gè)階段試驗(yàn)的二個(gè)階段n第一個(gè)階段：試驗(yàn)中先加入反應(yīng)系統(tǒng)讓其有優(yōu)先結(jié)合的機(jī)會；n第二階段：為SRBCS與補(bǔ)

34、體結(jié)合的階段。n如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的相應(yīng)抗體（或抗原），則反應(yīng)的第一階段抗原抗體復(fù)合物結(jié)合補(bǔ)體，此時(shí)由于補(bǔ)體已被子結(jié)合掉，反應(yīng)液中已無游離補(bǔ)體，故第二階段加入指示系統(tǒng)不出現(xiàn)溶血，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。n如果反應(yīng)系統(tǒng)中抗原（或抗體）缺乏，或兩種不對應(yīng)，則反應(yīng)的第一階段補(bǔ)體游離，與第二階段加入的指示系統(tǒng)結(jié)合出現(xiàn)溶血，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。n試驗(yàn)中將反應(yīng)系統(tǒng)的待測抗原（或抗體）作系列倍比稀釋可作定量測定。n試驗(yàn)中以50%不溶血作為判斷終點(diǎn)。精選ppt補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)示意圖精選ppt二、試驗(yàn)方法二、試驗(yàn)方法（一）試劑制備1、抗原：用于檢測抗體的抗原應(yīng)以適當(dāng)方法純化，以保證試驗(yàn)的特異性。 如使用成分復(fù)雜的粗制抗

35、原，可通過勻漿和反復(fù)凍融，初步提取可溶性抗原，經(jīng)3000r/min離心20min去沉渣，取上清液再經(jīng)10000r/min離心1h，取上清液作抗原。如使用此類粗制抗原，須用經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對照，以排除非特異性反應(yīng)。 精選ppt2、抗原和抗體的滴定：n一般采用方陣滴定法，選擇抗原與抗體均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（100%不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價(jià)（或單位）。n滴定方法：各試管中加入不同稀釋度的抗原和抗體及另作不加抗原的抗體對照管和不加抗體的抗原對照管。再依照試驗(yàn)方法加補(bǔ)體和指示系統(tǒng)，經(jīng)溫育后觀察溶血反應(yīng)情況。n正式試驗(yàn)中，抗原一般用2-4個(gè)單位（1:32-1:16），抗體采用4個(gè)單位（

36、1:8）。半年左右可復(fù)查其效價(jià)是否變化。精選ppt抗原和抗體效價(jià)的方陣滴定注圖中可見：1:64的抗原為1個(gè)單位； 1:32的抗體為1個(gè)單位；精選ppt3、補(bǔ)體的滴定 采用豚鼠血清為補(bǔ)體采用豚鼠血清為補(bǔ)體 對補(bǔ)體進(jìn)行滴定和確定其用量，對補(bǔ)體進(jìn)行滴定和確定其用量，以能產(chǎn)生完全溶血的最少補(bǔ)體用以能產(chǎn)生完全溶血的最少補(bǔ)體用量為量為1 1個(gè)實(shí)用單位個(gè)實(shí)用單位 正式試驗(yàn)時(shí)使用正式試驗(yàn)時(shí)使用2 2個(gè)實(shí)用單位個(gè)實(shí)用單位 補(bǔ)體的性質(zhì)不穩(wěn)定，每次試驗(yàn)補(bǔ)體的性質(zhì)不穩(wěn)定，每次試驗(yàn)前均應(yīng)進(jìn)行滴定前均應(yīng)進(jìn)行滴定 精選ppt補(bǔ)體的滴定：1：60的補(bǔ)體0.12ml可產(chǎn)生完全溶血，此為1個(gè)實(shí)用單位。按比例公式（0.122：60

37、0.2：X，經(jīng)計(jì)算X50，即實(shí)際應(yīng)用中的2個(gè)實(shí)用單位應(yīng)為1：50稀釋的補(bǔ)體0.2ml。精選ppt（二）血清標(biāo)本 采血并及時(shí)分離血采血并及時(shí)分離血清用于檢測或清用于檢測或2020保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆谩?試驗(yàn)前，應(yīng)先將血試驗(yàn)前，應(yīng)先將血清清5656加熱加熱30min30min（或（或603min603min）以滅）以滅活補(bǔ)體?；钛a(bǔ)體。 n血清標(biāo)本遇有抗補(bǔ)體現(xiàn)象時(shí)，血清標(biāo)本遇有抗補(bǔ)體現(xiàn)象時(shí)，n可作下列處理：可作下列處理：n加熱滅活時(shí)提高加熱滅活時(shí)提高12 n20凍融后離心去沉淀凍融后離心去沉淀 n以以3mmol/L鹽酸處理鹽酸處理 n加入少量補(bǔ)體后再行滅活加入少量補(bǔ)體后再行滅活 n以白陶土處理以白陶土

38、處理 n通入通入CO2 n以小白鼠肝粉處理以小白鼠肝粉處理 n用含用含10新鮮雞蛋清的生理鹽水新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋血清稀釋血清 精選ppt（三）正式試驗(yàn)n按補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作程序逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各種對照管，且應(yīng)與預(yù)期結(jié)果相符。n陰性、陽性對照管分別應(yīng)為明確的溶血與不溶血；n抗體或抗原對照管、待檢血清對照管、陽性和陰性對照的對照管應(yīng)完全溶血；nSRBC對照管不應(yīng)出現(xiàn)自發(fā)性溶血。n補(bǔ)體對照管中2U應(yīng)全溶，1U全溶或微不溶，0.5U應(yīng)不溶。若0.5U補(bǔ)體對照管出現(xiàn)明顯溶血，表示補(bǔ)體用量過多；如2U不出現(xiàn)完全溶血，則表明補(bǔ)體用量不夠，對結(jié)果的正確性均有影響，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。nCFT結(jié)果，受

39、檢血清管不溶血為陽性，溶血為陰性。精選ppt補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的操作程序精選ppt三、方法學(xué)評價(jià)三、方法學(xué)評價(jià) n優(yōu)點(diǎn)：n補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)敏感性高，能測定0.05g/ml的抗體；n特異性強(qiáng)，由于各反應(yīng)成分事先經(jīng)過滴定，比例適當(dāng)，出現(xiàn)交叉反應(yīng)的幾率較?。籲反應(yīng)結(jié)果明顯，溶血與不溶血易于區(qū)分；n試驗(yàn)條件要求低，容易普及，不需特殊儀器或只用分光光度計(jì)檢測溶血反應(yīng)后的血紅蛋白量；n應(yīng)用面廣，不同性狀的抗原和抗體均可檢測。精選pptn缺點(diǎn)：n參與成分多，影響因素復(fù)雜，操作繁瑣且要求嚴(yán)格，稍有疏忽便影響結(jié)果。n補(bǔ)體性質(zhì)不夠穩(wěn)定，難于標(biāo)準(zhǔn)化，且抗原或待檢血清可能有抗補(bǔ)體作用。n現(xiàn)代化、自動化抗原抗體檢測方法的不斷涌現(xiàn)

40、，現(xiàn)代化、自動化抗原抗體檢測方法的不斷涌現(xiàn)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)逐漸被遺棄補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)逐漸被遺棄n補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)作為一種經(jīng)典的免疫方法類型，其補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)作為一種經(jīng)典的免疫方法類型，其設(shè)計(jì)和原理仍對新型免疫方法的建立有著啟迪和設(shè)計(jì)和原理仍對新型免疫方法的建立有著啟迪和指導(dǎo)作用指導(dǎo)作用 精選ppt第五節(jié)第五節(jié) 補(bǔ)體受體的測定補(bǔ)體受體的測定補(bǔ)體受體：補(bǔ)體受體：存在于多種細(xì)胞，是清除免疫復(fù)存在于多種細(xì)胞，是清除免疫復(fù)合物、凈化機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要膜性成分合物、凈化機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要膜性成分 檢測補(bǔ)體受體，有助于判斷機(jī)體抗感染能力檢測補(bǔ)體受體，有助于判斷機(jī)體抗感染能力和計(jì)數(shù)相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量和計(jì)數(shù)相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量 精選pp

41、t補(bǔ)體受體目前已知的補(bǔ)體受體歸為目前已知的補(bǔ)體受體歸為以下五類：以下五類：CR1（CD35） CR2（CD21） CR3（CD11b/CD18） CR4(gp150/95，CD11c/18) C3aR/C5aR精選ppt名名 稱稱 別別 名名 CDCD分類分類 配配 體體 細(xì)細(xì) 胞胞 分分 布布 CR1 CR1 C3bC3b受體，受體，C4B/C3bC4B/C3b受體受體 CD35 CD35 iC3biC3b、C3bC3b，C4bC4b、iC4biC4b，C3c C3c 紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞細(xì)胞、

42、樹突狀細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞 CR2 CR2 C3dC3d受體，受體，EBEB病毒病毒受體受體 CD21 CD21 iC3biC3b、C3dgC3dg、C3dC3d、EBEB病毒、病毒、IFN- IFN- B B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 CR3 CR3 iC3biC3b受受體、體、Mac-1Mac-1抗抗原原 CD11b/CD11b/CD18 CD18 iC3biC3b、植物凝集素、某些細(xì)、植物凝集素、某些細(xì)胞多糖胞多糖 中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞、NKNK細(xì)胞細(xì)胞 CR4 CR4 gp150/9gp150/95 5 CD11C/CD11C/CD18 CD18 iC3biC3b、C3dC3d、C3dg C3dg 中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板 C5aR/ C5aR/ C3aRC3aRCD88CD88C5a/C3a(C5a/C3a(活化活化G G蛋白蛋白) )內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、吞噬細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、吞噬細(xì)胞補(bǔ)體受體特性精選ppt第六節(jié) 補(bǔ)體測定的應(yīng)用n補(bǔ)體系統(tǒng)及其單個(gè)成分