食品微生物學(xué)_第六章

1、第六章第六章 食品中的微生物及其產(chǎn)物的鑒定食品中的微生物及其產(chǎn)物的鑒定微生物檢測技術(shù)：微生物檢測技術(shù)：v定量：定量： 微生物數(shù)量的測定微生物數(shù)量的測定v定性定性：根據(jù)各種性狀特征，對微生物：根據(jù)各種性狀特征，對微生物 的種類鑒別。的種類鑒別。1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1mlDEFT微菌落計數(shù)微菌落計數(shù) 僅用于活細(xì)胞的檢測僅用于活細(xì)胞的檢測 原理：原理： 食品勻液經(jīng)食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，膜膜過濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長出，顯微鏡觀察落長出，顯微鏡觀察 G- 3h G+ 6h MPN的缺點(diǎn)

2、：的缺點(diǎn)：l需要大量的玻璃器皿（特別是需要大量的玻璃器皿（特別是5試試管實驗）管實驗）l不能觀察微生物菌落的形態(tài)不能觀察微生物菌落的形態(tài)l準(zhǔn)確性不高準(zhǔn)確性不高主要包括：主要包括：l 大腸埃希氏菌屬大腸埃希氏菌屬 （Escherichia） l 檸檬酸桿菌屬檸檬酸桿菌屬 （Citrobacter）l 克雷氏菌屬克雷氏菌屬 （Klebsiella）l 產(chǎn)氣腸桿菌屬產(chǎn)氣腸桿菌屬 （Enterobacter）非典型大腸桿菌非典型大腸桿菌典型大腸桿菌典型大腸桿菌 目前，大腸菌群已被我國和許多國家用目前，大腸菌群已被我國和許多國家用作作食品質(zhì)量評價食品質(zhì)量評價的指示菌。一般認(rèn)為，的指示菌。一般認(rèn)為，大腸菌

3、群都是直接或間接來自人與溫血大腸菌群都是直接或間接來自人與溫血動物的動物的糞便糞便。 3、大腸菌群檢測方法與檢驗結(jié)果、大腸菌群檢測方法與檢驗結(jié)果 檢驗結(jié)果檢驗結(jié)果：用每用每100mL（g）樣品中）樣品中 大腸菌群最近似數(shù)來表示，大腸菌群最近似數(shù)來表示， 簡稱大腸菌群簡稱大腸菌群MPN.檢測方法：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)、檢測方法：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)、 證實試驗證實試驗 見見GB4789.3-1994兩種染料：兩種染料：應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)應(yīng)用及優(yōu)、缺點(diǎn)抗原（抗原（Antigen，Ag）Antigens are macromolecules that elicit an immune respons

4、e in the body. Antigens can be proteins polysaccharides conjugates of lipids with proteins (lipoproteins) and polysaccharides ( glycolipids ). Antibodies are immune system-related proteins called immunoglobulins（Ig）. Each antibody consists of four polypeptides two heavy chains and two light chains j

5、oined to form a Y shaped molecule. 抗體（抗體（Antibody，Ab）1.基因探針技術(shù)基因探針技術(shù)探針（探針（Probe）：經(jīng)過）：經(jīng)過標(biāo)記標(biāo)記的一段的一段短核苷酸短核苷酸，用于檢測與之，用于檢測與之同源同源的核的核苷酸序列。苷酸序列。Probe is a short labelled nucleotide used to detect homologous nucleotide sequence .Length of probe： 20-1000bpType of probe： Oligonucleotide probes （20-40 bp） Singl

6、e stranded DNA probes （200-500 bp ） Double stranded DNA probes RNA probes or Riboprobes Radioactive ：32P、35S、 3H、14C Digoxigenin （Dig） Biotin Fluorescent dyeChoice of Labelling： Non-radioactive ： 可檢測的細(xì)胞數(shù)量：可檢測的細(xì)胞數(shù)量： 10106 6 -10107 7 必須進(jìn)行細(xì)胞富集必須進(jìn)行細(xì)胞富集 ！ 探針檢測的靈敏度與檢測時間探針檢測的靈敏度與檢測時間細(xì)胞數(shù)量為細(xì)胞數(shù)量為 10108 8，檢測需要

7、，檢測需要10-12h 2.DNA擴(kuò)增法擴(kuò)增法（1）多聚酶鏈反應(yīng)）多聚酶鏈反應(yīng) Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美國年，美國PE-Cetus 公司人類遺傳公司人類遺傳學(xué)研究室的學(xué)研究室的Kary Mullis 發(fā)明發(fā)明 1993年，年，Mullis 獲得諾貝爾獲得諾貝爾化學(xué)獎化學(xué)獎三步曲：三步曲： 變性（變性（Denaturation） 退火（退火（Annealling） 延伸（延伸（Extension）一個循環(huán)一個循環(huán)（cycle）一般進(jìn)行一般進(jìn)行25-30個循環(huán)個循環(huán)PCR反應(yīng)的三步曲與五要素反應(yīng)的三步曲與五要素 Step 1Step 1：雙鏈雙鏈D

8、NADNA熱變熱變性（性（9494）；）；Step 2Step 2：引物與模板引物與模板單鏈單鏈DNADNA退火（退火（5555）；）；Step 3Step 3：DNADNA的聚合延的聚合延伸反應(yīng)（伸反應(yīng)（7272）；）；Step 4Step 4：擴(kuò)增的雙鏈擴(kuò)增的雙鏈DNADNA再次熱變性（返回再次熱變性（返回Step 1Step 1）。）。五要素：五要素：循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量實際：實際：Nf = N0 （1 + Y）N其中其中Y Y為擴(kuò)增效率為擴(kuò)增效率理論：理論：Nf = N0 X 2 N 其中其中N為循環(huán)次數(shù)，為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，為起始拷貝數(shù)，Nf為最終拷貝數(shù)為最

9、終拷貝數(shù)Denaturing94 oCTemperature100055T i m e5335PCRDenaturing94 oCTemperature100055T i m e3553HeatDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e355355Denaturing94 oCDenaturing94 oCDenaturingng94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553HeatHeat5

10、55Denaturing94 oCDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553555555（2）隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性）隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA lDeveloped by Williams et al. (1990) using 10 base primers to generate random fragments from template DNAslRAPD fragments can be separated and used as genetic markers or a

11、 kind of DNA fingerprint Two related techniques: 1. Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) Welsh and McClelland (1990) longer primers(18-25 bases)2. DNA Amplification Fingerprinting (DAF) Caetano-Anolles et al. (1991) very short primers (8 bases) Components of PCR and RAPD RAPD1. Buffer (Mg+) usually high Mg

12、+ concentration2. Template DNAl1 short primer (10 bases) anneals to any specific part of the template DNA4. dNTPs5. TaqlTwo modifications made to typical thermal cycling when RAPD is being done:lAnnealing temperatures are generally very low, around 36 C - This allows very short primers to anneal to

13、template DNAlMore thermal cycles are used, typically 45 - This compensates for the inefficiency which results from using such short primers.Template DNAlPrimer binds to many locations on the template DNAlOnly when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point

14、 toward each other will amplification take placeRAPDTemplate DNAPrimers point away from each other, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers point in the same direction, so amplification wont happenRAPDTemplate DNAPrimers too far apart, so amplification wont happen 2,000 basesRAPDTemplate

15、 DNAPrimers are just the right distance apart, so fragment is amplified100 - 1,500 basesRAPD3.限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）Restriction Fragment Length Polymorphism保護(hù)細(xì)菌不受外來保護(hù)細(xì)菌不受外來DNA侵入侵入來自細(xì)菌的一種內(nèi)切酶來自細(xì)菌的一種內(nèi)切酶識別識別4-8 bp特定序列特定序列 (site specific)兩股兩股DNA上各上各產(chǎn)產(chǎn)生一生一個個切口切口回回文序列文序列 (palindrome sequence)5- GTT

16、ACATGA GATC ACGGATTC -33- CAATGTACT CTAG TGCCTAAG -5產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端 (cohesive end, sticky end)5- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAEcoR I5- TTACATGC3- AATGTACG GCMsp IAATT CACGGATTC -3 GTGCCTAAG -5CG GACGGAT -3 CTGCCTA -55- GTTACATGAG3- CAATGTACTCTTAAAATT CACGGATTC 3 GTGCCTAAG -55- TTACATGC3- AATGTACG GCCG GA

17、CGGAT -3 CTGCCTA -55-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAHpa I5- AACTGTCGG3- TTGACAGCCHae IIIAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 5CCAGGCTG -3GGTCCGAC -5產(chǎn)生平末端產(chǎn)生平末端(blunt end)5-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 55- AACTGTCGG3- TTGACAGCCCCAGGCTG -3GGTCCGAC -5R F LP 限 制 脢 圖 譜 多 形 性O(shè)riginal geneSingle base m

18、utationGene insertion/duplicationElectrophoresisprobeRestriction enzyme digestionJuang RH (2004) BCbasics一種檢測有動力的沙門氏菌的方法一種檢測有動力的沙門氏菌的方法優(yōu)點(diǎn)：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié)優(yōu)點(diǎn)：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié) 合起來，特異性強(qiáng)；合起來，特異性強(qiáng)； 不需特殊實驗室條件，簡便不需特殊實驗室條件，簡便 ； 8-14小時內(nèi)得出結(jié)果，快速小時內(nèi)得出結(jié)果，快速 。缺點(diǎn)：不能檢測非運(yùn)動型沙門氏菌，缺點(diǎn)：不能檢測非運(yùn)動型沙門氏菌， 免疫條帶的判斷有主觀因素。免疫條帶的判斷有主觀因素

19、。 Enzyme Linked Immunosorbent Assay1971年年Engvall和和Perlmann（ ELISA） can measure antibodies or antigens inexpensive, rapid, quantitative, specific sensitive (pg/ml) expensive equipment not required can be automated ELISA ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記?？乖蚩贵w的酶標(biāo)記。 結(jié)合在固相載體結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。性，又保留酶的活性。原理：原理：待測樣品與固相載體表面的抗原或抗體起反待測樣品與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體也結(jié)合在固相應(yīng)，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體也結(jié)合在固相載體上。此時載體上。此時固相上的酶量與樣品中受檢物固相上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，