掌握這 8 點令 PCR 引物設計事半功倍

1、掌握這 8 點令 PCR 引物設計事半功倍 臨門一腳，先講核心，掌握核心，引物設計任你馳騁。 引物長度 引物長度對反應特異性、解鏈溫度、退火時間都有較大的影響，最終影響到 PCR 反應 是否成功。多數(shù)情況下，引物長度約 1830bp, 引物太短會導致非特異擴增，太長雖然會增加特異性，但是二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)的概率增大。 引物的解鏈溫度 PCR 反應的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數(shù) PCR 反應的 解鏈溫度應在 5560，如果沒有其他不穩(wěn)定因素，引物的 Tm 值取決于它的長度、序列組成和濃度，離子強度的影響可以忽略不計，因為不同的 PCR 反應鹽濃度變化不大。 一個

2、反應中所有引物的解鏈溫度應盡可能接近。對于多數(shù) PCR 反應而言，引物之間的 差應小于 23。差值增大，反應效率會降低，甚至直接導致反應失敗。因為 Tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯配，而 Tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只 有低濃度結(jié)合。 可利用以最近鄰熱力學理論為基礎的公式估算 Tm 值，該理論分析了復式解鏈的熱力學過程。 Tm = H/S-RIn(c)-273.15（公式 1） 復式構(gòu)成物中焓變（H）和熵變（S ）可借助于最近鄰熱力學參數(shù)計算，為摩爾氣 體常數(shù)，c 為寡核苷酸的物質(zhì)的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對復式構(gòu)成物的自由能 的影響，該影響由序列中的最近鄰造

3、成。最近鄰從 5' 末端起始，焓和熵的效應是加性的。在式（1）中加人另一個條件，以經(jīng)驗性地計算鹽對復式構(gòu)成物的穩(wěn)定性的影響。 Tm =H/ S + R In(c) - 273.15 + 12.0lgNa+ （公式 2） 大多數(shù)引物設計軟件都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近鄰參數(shù)系統(tǒng)估算寡核苷酸復式構(gòu)成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。 對于由 20 個或更少個堿基組成的短序列，可用 Wallace 原理計算其位近似值。該 公式假定鹽的濃度為 0.9 mol/L，這是斑點雜交分析的常用濃度。 Tm

4、 = 2 * (A + T) + 4 * (G + C) （公式 3） 一般來說，退火溫度比引物解鏈溫度低 5°C。但是，根據(jù)這一原則得出的退火溫度常常 并不是的，必須通過實驗獲得溫度。利用梯度熱循環(huán)儀很容易實現(xiàn)這一目的。另外，可利用更精確的公式計算乃值（退火溫度）（Rychliketal.1990)。 Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 產(chǎn)物 Tm 值 - 25 （公式 4） 復制子的解鏈溫度 除了計算引物的解鏈溫度以外，還要保證產(chǎn)物的解鏈溫度要足夠低，以保證其在 92 時完全解鏈。一般來說，100600bp 的片段可以有效擴增。該參數(shù)有助于使 PCR 效率

5、更高，但并不總是成功的 PCR 所必需的。產(chǎn)物的 Tm 值可根據(jù)（式 5） 計算。 Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10K+)+0.41(%G+C) - 675/長度 （公式 5） 二級結(jié)構(gòu) 設計引物時，另一個需要考慮的重要因素是二級結(jié)構(gòu)的存在。一個帶有自身同源序列的引物可以回折形成部分雙鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。類似地，引物之間的同源可能引起引物二聚體的形 成。PCR 反應時，相對于模板而言，引物濃度髙很多，引物之間相互退火要比引物與模板 之間退火容易得多。因此，引物如果存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體，對于 PCR 擴增往往 是致命的，因為這樣會導致非特異的大量背景產(chǎn)物的擴增。避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)的最簡

6、單的方 法是：選擇 GC 含量約 50%、四種堿基中缺少一種的引物。 重復 同一堿基或幾個核苷酸的重復也應盡量避免。不同的重復對 PCR 反應的影響見表 1。 GC 夾 在引物的 3'端包含一個 G 或 C 殘基可增加引物擴增效率，這就是所謂的GC 夾。它 可以促進引物的 3'端正確地結(jié)合到模板，因為 GC 夾可以形成更為穩(wěn)定的氫鍵，因此可以提髙擴增的特異性。以胸腺嘧啶結(jié)尾的引物的特異性有降低的趨勢。 高 GC 含量片段的擴增 為了擴增高 GC 含量的 DNA，應該設計 Tm 值（為 7580) 較高的引物。髙 GC 含量的 DNA 雙鏈完全解開所需的溫度明顯較一般的 DNA 高。溫度較低時，PCR 復制子的兩條單鏈有較快地重新退火的趨勢，可與引物退火相互競爭。因此，PCR 過程中退火溫度較髙有助于引物退火，因此可以提髙擴增效率。