【課件】第1章第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（第2課時(shí)）（人教版2019選擇性必修3）

1、 自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時(shí)，要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時(shí)，更難實(shí)現(xiàn)。更難實(shí)現(xiàn)。稀釋涂布平板稀釋涂布平板法法呈呈現(xiàn)的雜菌群現(xiàn)的雜菌群選擇性必修選擇性必修3 3第第1 1章第章第2 2節(jié)微節(jié)微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第第2 2課時(shí)課時(shí) 微生物的微生物的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)和計(jì)數(shù)1 1. . 闡明微生物選擇培養(yǎng)的原理。闡明微生物選擇培養(yǎng)的原理。2 2. . 進(jìn)行土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。進(jìn)行土壤中

2、分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。尋找耐高溫的尋找耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶啟示啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對生存環(huán)境生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。篩選原因篩選原因：因?yàn)闊崛模阂驗(yàn)闊崛母邷馗邷貤l件條件淘汰淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的TaqTaq細(xì)菌細(xì)菌保留保留下來。下來。PCRPCR是一種在體外是一種在體外DNADNA復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。19661966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中

3、發(fā)現(xiàn)了耐熱的年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的TaqTaq細(xì)細(xì)菌，并分離到耐高溫的菌，并分離到耐高溫的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。一、選一、選擇培養(yǎng)基擇培養(yǎng)基耐高溫的酶耐高溫的酶耐高溫生物體耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找尋找尋找培養(yǎng)基中加培養(yǎng)基中加氨芐青霉素氨芐青霉素具有具有氨氨芐青霉芐青霉素抗性素抗性的菌落的菌落沒有沒有氨氨芐青霉芐青霉素抗性素抗性的的細(xì)菌細(xì)菌培養(yǎng)基應(yīng)培養(yǎng)基應(yīng)有菌落有菌落沒有沒有氨芐青霉素抗氨芐青霉素抗性性的的細(xì)菌細(xì)菌被淘汰被淘汰怎樣怎樣選擇選擇出出抗氨芐青霉素能力抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌的細(xì)菌?

4、?2.2.例：例：一、選一、選擇培養(yǎng)基擇培養(yǎng)基3.3.實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供人為提供有利于目的菌株有利于目的菌株生長的條件生長的條件( (包括營養(yǎng)、溫度、包括營養(yǎng)、溫度、pHpH等等) )，同，同時(shí)時(shí)抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物生長。生長。一、選一、選擇培養(yǎng)基擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，叫做叫做選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。4.4.選擇培養(yǎng)基舉例選擇培養(yǎng)基舉例不加有機(jī)碳源不加有機(jī)碳源自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物不加氮源不加氮源固氮微生物固氮微生物

5、加入青霉素加入青霉素酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌( (青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌) )加高濃度食鹽加高濃度食鹽金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌石油是唯一碳源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì) 尿素尿素CO(NH2)2CO(NH2)2含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤施入土壤后，會后，會被土壤中被土壤中的的某些細(xì)菌分解成某些細(xì)菌分解成NH3NH3，再被轉(zhuǎn)化為，再被轉(zhuǎn)化為NO3-NO3-、NH4+NH4+等被植物吸收等被植物吸收

6、。而這些細(xì)菌之所以能分。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕福迕复呋蛩胤纸饽蛩?，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生解產(chǎn)生NH3NH3，NH3NH3可以作為細(xì)菌生長的氮源?？梢宰鳛榧?xì)菌生長的氮源。討論：討論：1.1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？在選擇培養(yǎng)基中，在選擇培養(yǎng)基中，以尿素作為唯一氮源以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細(xì)菌才能生長發(fā)只有能合成脲酶的細(xì)菌才能生長發(fā)育繁殖育繁殖2.2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不

7、同點(diǎn)？該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？ 除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同一、選一、選擇培養(yǎng)基擇培養(yǎng)基二、微生物的選擇培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)1.1.方法：方法：稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法2.2.操作流程操作流程鏟取土樣，將鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中樣品裝入紙袋中將將10g10g土樣加入盛有土樣加入盛有90mL90mL無無菌水菌水的錐形瓶中，充分的錐形瓶中，充分搖勻搖勻，制成制成菌液菌液。取取1mL1mL上清液加入上清液加入盛有盛有9mL9mL無菌水無菌水的試管中，的試管中，依依次等比

8、稀釋次等比稀釋。1101107 71101105 51101106 61101103 31101102 21101104 49mL9mL無菌水無菌水11011090mL90mL無菌水無菌水1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L1m1mL L取取0 0. .1mL1mL菌液，菌液，滴加到（選擇）滴加到（選擇）培養(yǎng)基培養(yǎng)基表面表面。將涂布器將涂布器浸在浸在盛有盛有酒精酒精的燒杯中。的燒杯中。將涂布器放在將涂布器放在火焰上灼火焰上灼燒燒，待酒精，待酒精燃盡燃盡、涂布器、涂布器冷卻冷卻后，再進(jìn)行涂布后，再進(jìn)行涂布用用涂布器涂布器將菌液將菌液均勻均勻地地涂布涂布在培養(yǎng)基表

9、面。涂布時(shí)在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿，使涂布均勻。，使涂布均勻。3.3.注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：10g10g土樣土樣加入盛加入盛有有90mL90mL無菌水中后，無菌水中后，已稀釋已稀釋1010倍倍，在計(jì)算時(shí)，不要忽略；，在計(jì)算時(shí)，不要忽略；由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因?yàn)榈驗(yàn)橛行┪⑸锟梢岳媚康木拇x產(chǎn)物來生長繁殖有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證；進(jìn)一步驗(yàn)證；過程中所有操作都應(yīng)在過程中所有操作都應(yīng)在酒精燈火焰旁酒精燈火焰旁進(jìn)行；進(jìn)行

10、；將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。酒精。二、微生物的選擇培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)4.4.培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)觀察： 放入放入3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)1 12d2d三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法1.1.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法（1 1）原理：原理： 當(dāng)樣品的稀釋度足夠當(dāng)樣品的稀釋度足夠_時(shí)，時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個培養(yǎng)基表面生長的一個_，來源于，

11、來源于_中的一個中的一個_；通過計(jì)數(shù)平；通過計(jì)數(shù)平板上的板上的_數(shù)，就能推測出樣品中大約數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少含有多少_；高高菌落菌落樣品稀釋液樣品稀釋液活菌活菌菌落菌落活菌活菌（2 2）計(jì)數(shù)原則計(jì)數(shù)原則選擇菌落數(shù)為選擇菌落數(shù)為_的平板計(jì)數(shù)的平板計(jì)數(shù)30-30030-300同一同一稀釋度下，應(yīng)稀釋度下，應(yīng)至少至少對對_個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出_；3 3平均值平均值樣品的樣品的_將直接影響平板上的菌落數(shù)目；將直接影響平板上的菌落數(shù)目；稀釋度稀釋度（3 3）結(jié)果分析結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目_； 原因：原因：

12、_ _ _統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用_而不是用活菌數(shù)來表示；而不是用活菌數(shù)來表示；少少當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個菌落是一個菌落菌落數(shù)菌落數(shù)（4 4）計(jì)算公式：計(jì)算公式：每每g g樣品中的菌落數(shù)樣品中的菌落數(shù)(C(CV)V)M MC C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)(mL)M M代表稀釋倍數(shù)代表稀釋倍數(shù)三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定2 2. .顯微鏡直接計(jì)數(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法（1

13、 1）方法方法： 利用特定的利用特定的_或或_在在_下觀察、下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算_的樣品中微生物的數(shù)量；的樣品中微生物的數(shù)量；細(xì)菌計(jì)數(shù)板細(xì)菌計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡顯微鏡一定體積一定體積血細(xì)胞計(jì)數(shù)板常用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板常用于_等的計(jì)數(shù)等的計(jì)數(shù)相相對對較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對_進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)；進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)；細(xì)菌等較小的細(xì)胞細(xì)菌等較小的細(xì)胞（2 2）優(yōu)點(diǎn)：）優(yōu)點(diǎn)：快速直觀快速直觀（3 3）缺點(diǎn)：）缺點(diǎn)：統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)的的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分死菌不能區(qū)分死菌與活菌與活菌

14、。個體小的細(xì)菌個體小的細(xì)菌在顯微鏡下在顯微鏡下難以觀察難以觀察。三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定四、土四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)1.1.土壤取樣土壤取樣2.2.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基3.3.樣品稀釋、取樣涂布樣品稀釋、取樣涂布4 4. .微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果5 5. .細(xì)菌的計(jì)數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)1.1.土壤取樣土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。先準(zhǔn)備好的信封中。2.2.制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基

15、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。判斷選擇培養(yǎng)基是否起到選擇作用。選用稀釋倍數(shù)為選用稀釋倍數(shù)為10103 310107 7的稀釋液。每個稀釋度下需要的稀釋液。每個稀釋度下需要3 3個選擇培養(yǎng)基（平行個選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)原則），重復(fù)原則），1 1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要制備制備5 5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和和1515個選擇培養(yǎng)基，個選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。3.3.樣品稀釋、取樣涂布樣品稀釋、取樣涂布測定土壤細(xì)菌數(shù)量，一般選用測定土壤細(xì)菌數(shù)量，一般選用101

16、04 4、10105 5和和10106 6倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測定倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測定放線菌的數(shù)量，一般選用放線菌的數(shù)量，一般選用10103 3、10104 4和和10105 5倍稀釋液；測定真菌的數(shù)量，一般選倍稀釋液；測定真菌的數(shù)量，一般選用用10102 2、10103 3和和10104 4倍稀釋液。倍稀釋液。因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏囊驗(yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量是不同的，數(shù)量是不同的，為獲得不同類型的微生物，就需要為獲得不同類型的微生物，就需要按按不同的稀釋度不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。將將10g10

17、g土樣加入盛有土樣加入盛有90mL90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中無菌生理鹽水的錐形瓶中, ,充分搖勻，吸取上清液充分搖勻，吸取上清液1mL1mL，轉(zhuǎn)移至盛有，轉(zhuǎn)移至盛有9mL9mL水的無菌試管中，依次等比稀釋至水的無菌試管中，依次等比稀釋至10107 7稀釋度，并按照稀釋度，并按照由由10107 7至至10103 3稀釋度的順序分別吸取稀釋度的順序分別吸取0.1mL0.1mL進(jìn)行進(jìn)行平板涂布操作平板涂布操作。按照濃度從。按照濃度從低低到高的順序涂布平板到高的順序涂布平板，不必更換移液管。，不必更換移液管。注意：注意：由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀

18、釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。四、土四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)4 4. .微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果將涂布好的培養(yǎng)皿放在將涂布好的培養(yǎng)皿放在3030下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌細(xì)菌一一般在般在30373037的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)

19、12d12d；放線菌放線菌一般在一般在25282528的溫度下培的溫度下培養(yǎng)養(yǎng)57d57d；而；而霉菌霉菌一般在一般在25282528的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)34d34d。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下( (相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間) )，同，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如菌落種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如菌落形狀、大小、隆起程度和顏色。形狀、大小、隆起程度和顏色。5.細(xì)菌的計(jì)數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在3030030300的的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少

20、對下，至少對3 3個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。( (一一) )無菌操作無菌操作1.1.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2.2.應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞塞。3.3.在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。( (二）做好標(biāo)記二）做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。（三）規(guī)劃時(shí)間（三）規(guī)劃時(shí)間三、操作提示三、操作提示四、土四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與記數(shù)微生物的微生物的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)和計(jì)數(shù)1 1（20212