基因工程復(fù)習(xí)資料

1、一、 名詞解釋1、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。2、回文結(jié)構(gòu)（palindrome）：序列正讀和反讀是一樣的，即有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向讀序列是完全一樣的。在切割位點(diǎn)處，限制性核酸內(nèi)切酶的作用下磷酸二酯鍵會(huì)發(fā)生水解效應(yīng)，從而導(dǎo)致鏈的斷裂。3、基因組文庫(kù)：提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列。4、cDNA文庫(kù)：mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以根據(jù)克隆的cDN

2、A分子的核苷酸序列推導(dǎo)出來(lái)。5、熒光定量PCR： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。6、Ct值的定義：擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)。7、基因重組：是依賴(lài)于限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對(duì)外源目的基因的片段和表達(dá)載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將外源片段和表達(dá)載體巧妙的連接起來(lái)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。8、轉(zhuǎn)化：大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)染：大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。9、1.核酸探針

3、：核酸探針是指帶有標(biāo)記的與目 的基因同源互補(bǔ)的一段核苷酸序列。 大?。洪L(zhǎng)度以50-300個(gè)堿基為宜 種類(lèi)：DNA探針、CDNA探針、RNA探針 10、基因表達(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。11、轉(zhuǎn)基因食品（Genetically Modified Foods，GMF）是利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人們所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。 12、原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過(guò)酶；A編碼-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。 13、載體：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫做

4、載體 14、質(zhì)粒：是染色體以外能夠自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，它廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中。二、 簡(jiǎn)答題1、Klenow酶的基本性質(zhì)：1)大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端2）三分之二的大肽段，即為Klenow酶3)Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性2、Klenow酶的基本用途 1）補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端2）DNA片段的同位素末端標(biāo)記3）cDNA第二鏈的合成4）雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列3、DNA連接酶的基本性質(zhì) 修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵 4、基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟（1） 基因組DNA的提?。?/p>

5、2）DNA克隆片段的制備（3）載體與基因組DNA大片段的連接4. 基因組文庫(kù)的大小5. 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及保存5、構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟6、PCR的基本原理及步驟類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：7、PCR反應(yīng)體系緩沖液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶8、烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過(guò)程：1）吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2)注入 噬菌體DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3)轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4)合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白

6、質(zhì)5)組裝 包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6)釋放 子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)9、DNA分子的轉(zhuǎn)化過(guò)程 吸附:完整的雙鏈DNA吸附在受體菌表面 轉(zhuǎn)入:雙鏈DNA分子解鏈 單鏈DNA進(jìn)入受體菌,另一鏈降解 自穩(wěn):單鏈DNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈環(huán)狀 表達(dá):外源基因同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯 10、提高外源基因表達(dá)效率的方法 1）選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac 等 2）調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離 ， 一般為5-9bp 3）改變起始密碼下面的幾組密碼子 ，能提高翻譯的起始效率 4）增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 5） 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 6）提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性11、外源基因在原核

7、細(xì)胞中表達(dá)具備條件 1）通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。 2)外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA。 3)必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)。 4)外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。 5)利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。 12、pBR322的三個(gè)親本：pSF2124、pSC101、pMB1第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的

8、四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。13、基因工程的基本過(guò)程.1）基因的剪刀限制性?xún)?nèi)切酶（限制酶）基因操作的過(guò)程（連） DNA連接酶3） 基因操作的過(guò)程（轉(zhuǎn)） 運(yùn)載體4） 基因操作的過(guò)程（增） 轉(zhuǎn)化細(xì)胞5） 基因操作的過(guò)程（檢） 篩選鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞三、論述題1、PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法一）擴(kuò)增不出特異性帶1、原因 （1）引物設(shè)計(jì)有問(wèn)題（引物位置錯(cuò)誤，引物之間太強(qiáng)的相互作用） （2）反應(yīng)體系有問(wèn)題（3）退火溫度太高 2、解決辦法：（1）確認(rèn)引物正確性（2）用保證能擴(kuò)增出來(lái)的引物驗(yàn)證反應(yīng)體系 （3）采用梯度PCR功能，尋找最適合的退火溫度二）擴(kuò)增帶很弱 1、原因：（1）反應(yīng)體系效率低（2）退火溫度太高（3）很多非特異性擴(kuò)增（4）大量引物二聚物的形成 2、解決辦法：（1）用已確認(rèn)的引物驗(yàn)證 （2）采用梯度PCR功能尋最適的退火溫度（3）采用定量PCR的熔點(diǎn)曲線功能分析，提高退火溫度，改變反應(yīng)體系的PH值（三）非特異性擴(kuò)增帶很多 1、原因： （1）退火溫度太低（2）反應(yīng)體系有問(wèn)題2、解決辦法：（1）采用梯度PCR功能尋找最佳反應(yīng)溫度（2）更換反應(yīng)體系 （四）引物二聚物太多1、原因：（1）引物設(shè)計(jì)有