分子生物學實驗室工作手冊第十二章

1、分子生物學實驗室工作手冊分子生物學實驗室工作手冊分子生物學實驗室工作手冊第十二章：DNA、RNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNARNADNADNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度。DNA對紫外線有吸收作用，當核酸變性時，吸光值升高；當變性核酸可復性時，吸光值又會恢復到原來水平。溫度、有機溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以引起DNA分子變性，即使得DNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開。DNA介紹DNA是相當穩(wěn)定的，這是保存和傳遞遺傳信息的所必備的條件。但是對待DNA也不能大意，常常會DNA的污染。污染主要來源于其它的DNA。DNA的分離的分離概述：1.DNA的分離現(xiàn)已多用試劑

2、盒提取，有小量，中量，大量提取三種。實驗室一般銷小量提取多見。2.試劑盒可分離基因組，染色體組以外的DNA。如：瓊脂糖凝膠中分離DNA、PCR產(chǎn)物中分離DNA。3.一般分離試劑盒是使用結(jié)合DNA的樹脂或者濾膜，避免了酚抽提和CsCl超離心。4.染色體外的DNA作為噬菌體或者質(zhì)粒DNA被抽提出來。5.大片段的DNA(30Kb)，必須小心操作，防止斷裂。如：基因組。6.不同實驗對DNA的要求不一致，因此分離之后的鑒定也很重要，鑒定方法各不相同。例：酶切、測序等。一.DNA的分離1.堿堿-SDS質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒小量制備（1）培養(yǎng)物1.5ml，置于離心管內(nèi)。（2）10000g離心2min，棄上清。（3

3、）100ul預冷的solution重懸，振蕩2min。（4）常溫放置5min。（充分裂解釋放DNA）（5）200ul solution，上下顛倒5s。（不要太劇烈，振蕩會損傷DNA）（6）水浴5min，12000g離心5min。（7）加200ul冰上預冷的solution，上下顛倒20s，混勻。（8）水浴5min，12000g離心5min，將上清移至新的EP管內(nèi)。（9）加入5ul 2mg/mlRNaseA,37度放5min。（10）加入（450ml）的酚-氯仿抽提。（見后）（11）乙醇濃縮。(見后)（12）70%乙醇沉淀，離心1min，吸去上清，揮發(fā)干酒精。（13）25ulTE重懸沉淀，2-4

4、ul電泳。（14）-20保存。2.DNA酚抽提目的：去除DNA中的蛋白質(zhì)原理：酚和水互不相容，形成兩相，DNA溶于水相，蛋白質(zhì)溶于酚相。方法：DNA樣品+等體積的酚氯仿劇烈振蕩 20s常溫離心5min小心轉(zhuǎn)移上層水相于新的EP管加入等體積酚氯仿重復抽提。3.DNA乙醇濃縮沉淀目的：濃縮DNA，阻止許多沒反應的殘余氯仿。方法：DNA樣品（450ul）+十分之一體積的 pH4.2、3mol/l的NaAc快速顛倒混勻加入2倍體積的95%的無水乙醇，充分混勻冷環(huán)境中沉淀（-20過夜或者-70 30min或者干冰 5min）高速（12000g）離心15-30min去上清，揮發(fā)酒精預冷70%的乙醇洗滌，揮

5、發(fā)玩酒精加pH8.0TE重懸DNA。4.使用真空濃縮機(干燥濃縮的DNA)5.紫外分光光度計測定核酸濃度和純度紫外分光光度計測定核酸濃度和純度文本文本文本文本寡核苷酸（20bp）文本文本文本文本二.DNA的擴增-PCR聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。生物體外的特殊DNA復制。原理：PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3

6、)的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。PCR反應體系：引物(PCR引物為DNA片段，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。 10擴增緩沖液 10l 4種dNTP混合物 200l 引物 10100l 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5 l Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水 100 l PCR的注意事項 1.遠離PCR儀及其他污染源制備PCR樣品。 2.PCR的移液器與其他移液器分開使用，防止交叉污染。 3.實驗過程中戴手套和口罩，盡量不要說

7、話。 4.反應體系中最后才加DNA。三.將DNA導入細胞和微生物原核細胞 1.一般轉(zhuǎn)化法：擴增克隆的DNA（不表達載體的細菌） 獲得大量DNA編碼的蛋白質(zhì)（表達載體的細菌） 2.與高濃度的鈣離子溫育：操作簡單，耗時短，只需幾分鐘即可完成。 3.電轉(zhuǎn)化：最佳條件取決于細菌物種 注意：載體和所選的細胞類型是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵，實驗之前要選好。真核細胞真核細胞的轉(zhuǎn)化稱為轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)化+感染感染:病毒介導的基因傳遞報告基因：轉(zhuǎn)染的攜帶DNA的細胞會表達一些報告基因而被選擇出來。如：能抵抗某種抗生 素，GEP(綠色熒光蛋白)等。轉(zhuǎn)染的方法：1.磷酸鈣共沉淀法2.DEAE右旋糖酐介導的轉(zhuǎn)染3.脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染

8、4.電轉(zhuǎn)化5.微注射6.病毒介導的轉(zhuǎn)導 例：SV40、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等質(zhì)粒質(zhì)粒（Plasmid）：是一類存在于細菌和真菌細胞中獨立于DNA而自主復制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子（covalently closed circular DNA）,也稱為cccDNA,其大小通常在1100KB范圍內(nèi)。質(zhì)粒的分類 質(zhì)粒分為兩類：1.嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染 色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒；2.松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。質(zhì)粒質(zhì)粒的形式： 超螺旋DNA：在細菌細胞內(nèi)，共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存 在。 開環(huán)DNA：如果質(zhì)粒DNA兩

9、條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處 斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松弛 型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA。 線狀DNA：如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則 形成線狀DNA(LinearDNA）。 當提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分 子的泳動速度快。 當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA的兩條 鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變 性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超 螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。質(zhì)粒的提取從細菌中分離質(zhì)粒DNA的

10、方法都包括3個基本步驟：1.培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；2.收集和裂解細胞；3.分離和純化質(zhì)粒DNA。 采用強堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細菌）可以破壞菌體細胞壁。 十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使細胞膜裂解。 經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。堿堿-SDS質(zhì)粒小量制備質(zhì)粒小量制備（1）培養(yǎng)物1.5ml，置于離心管內(nèi)。（2）10000g離心2min，棄上清。（3）100ul預冷的solution重懸，振蕩2min。（4）常溫放置5min。（充分裂解釋放DNA）（5）200ul solution，上下顛倒5s。（不要太劇烈，振蕩會損傷DNA）（6）水浴5min，12000g離心5min。（7）加200ul冰上預冷的solution，上下顛倒20s，混勻。（8）水浴5min