蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

1、三、羧基的修飾用水溶性碳二亞胺作催化劑，通過胺專一地修飾蛋白質(zhì)中的羧基。ENZOCO+HNNCRRH+C+ENZHHONCON RRC+ENZHHONCON RR+ HXENZOCXC+HHNON RRH+C+ENZHHONCON RRCHNONRRHENZOC+碳二亞胺形成相應(yīng)酰胺重排四、巰基的修飾由于半胱氨酸時蛋白質(zhì)中反應(yīng)性最強(qiáng)的殘基，所以很多試劑可用來修飾巰基側(cè)鏈。常用的有三類：1.碘乙酸、碘乙酰胺或環(huán)乙烯亞胺2.馬來酰亞胺或馬來酸酐3.有機(jī)汞試劑（一）1類試劑是烷化劑，此類試劑還能與甲硫氨酸、賴氨酸或 組氨酸反應(yīng)。ENZS+ICH2COO-pH7ENZCH2+SCOO-I-碘乙酸半胱氨

2、酸副反應(yīng)：HENZNN+ICH2COO-pH5.5ENZCH2NNH+COO-I-+組氨酸CH3ENZSICH2COO-+pH=28.5CH3CH2ENZ+SCOO-I-NH2ENZICH2COO-+pH=8.5甲硫氨酸HNCH2HENZ+COO-I-+（二）2類試劑能與巰基形成對酸穩(wěn)定的衍生物，而與其它基團(tuán)形成的產(chǎn)物則對酸不穩(wěn)定。HENZSCH3CH2ONO+pH 5CCH3CHCCH2ONHENZCOSH副反應(yīng)：NH2ENZCH3CH2ONO+pH 7CCH3CHNCCH2HONHENZCOH半胱氨酸（三）3類試劑對巰基專一性最強(qiáng)。常用的是對氯汞苯甲酸，S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨

3、酸是對氯汞苯甲酸的衍生物，也可與巰基反應(yīng)。馬來酸酐ENZCH2HSCOO-HgCl+ENZ CH2SCOO-HgH+Cl對氯汞苯甲酸+N（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHg+S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸ENZSN（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHgHENZS（四）5，5-二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修飾巰基，它與半胱氨酸形成混合二硫化物。HENZS+SCOO-OOCO2NSNO2pH 6.5ENZSCOO-SNO2+H+SCOO-NO2DTNB2-硝基-5-硫代苯甲酸釋放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子在412nm處有吸收，可用光譜法測定其含量。五、組氨

4、酸咪唑基的修飾常用試劑是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。NHHONCNNHONCNCH2COO-NHONCNCH2COO-+NHONCNCH2COO-CH2COO-1-羧乙基組氨酸3-羧乙基組氨酸1，3-二羧乙基組氨酸HENZNN+CCH3CCH2OOOOOCH2CH3pH 47+HOCH2CH3CO2+焦碳酸二乙酯碘乙酸ICH2COO-+ICH2COO-+CCH3CH2ENZNNOO用碘乙酸烷化組氨酸殘基可得單取代或雙取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑環(huán)上的一個氮原子羧乙基化.羥胺可使反應(yīng)可逆進(jìn)行，回收組氨酸。NH2OH+pH =7CCH3CH2ENZNNOOHENZNNCCH3CH2HNOHOO+羥胺

5、六、色氨酸吲哚基的修飾（一）N-溴琥珀酰亞胺（NBS）常用來修飾色氨酸。它氧化吲哚基成為羥吲哚衍生物。酪氨酸也能與NBS作用。（二）各種芐基鹵化物能使吲哚環(huán)烷基化最常用的是2-羥基-5-硝基芐基溴，由于溶解度的問題，常用它的類似物二甲基（2-羥基-5-硝基芐基）锍鹽。應(yīng)注意的問題該試劑在水介質(zhì)、高pH下不穩(wěn)定，迅速水解為CO2和乙醇。試劑大大過量時可與咪唑環(huán)上的兩個氮都作用，形成雙取代衍生物。羥胺不能使雙取代物發(fā)生可逆反應(yīng)，而是清除咪唑環(huán)。NO2CH2BrOHENZNH2-羥基-5-硝基芐基溴+pH 7.5NO2ENZNHCH2OH+ HBrENZNHNO2ClS醋酸+NO2ENZNHS+ H

6、+ + Cl-對氯硫硝基苯帶硝基苯取代基的硫基鹵化物的專一性與锍鹽類似，但能產(chǎn)生單一產(chǎn)物，避免了锍鹽修飾產(chǎn)物的不均一性，而且產(chǎn)物的光譜性質(zhì)可用來定量測定色氨酸。七、酪氨酸酚基的修飾四硝基甲烷在溫和條件下可高度專一地硝化酪氨酸殘基，產(chǎn)生可電離的發(fā)色基團(tuán)3-硝基酪氨酸。色氨酸八、甲硫氨酸甲硫基的修飾用H2O2和過甲酸可將甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亞砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸殘基，能形成正甲硫鹽。九、絲氨酸羥基的修飾甲苯磺酰氟（PMSF)可與絲氨酸殘基作用。ENZOHCHC(NO2)4+ENZOHNO2CH-C(NO2)3 + H+四硝基甲烷3-硝基酪氨酸試 劑修 飾 的 側(cè) 鏈Lys Glu Cys A

7、rg Ser His Tyr Trp Met醋酸酐 ?；狒?醛 N-溴琥珀酰亞胺 碳二亞胺 苯異硫氰 四硝基甲烷 三硝基苯磺酸 焦碳酸二乙酯 碘乙酸 環(huán)乙烯亞胺 甲苯磺酰氟 馬來酰胺 常用重要修飾劑的專一性第四節(jié) 蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)雙功能試劑：具有兩個反應(yīng)活性部位，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內(nèi)、多肽鏈間或者蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變的試劑。一、設(shè)計或選擇交聯(lián)劑要考慮的因素（一）反應(yīng)的專一性交聯(lián)劑分為同型雙功能試劑異型雙功能試劑（二）交聯(lián)距離隨著交聯(lián)劑兩個功能基之間距離跨度的增加，形成交聯(lián)的可能性也隨之增加。（三）可裂解性研制可裂解交聯(lián)劑有助于分離和

8、表征交聯(lián)片斷。（四）反應(yīng)活性部分可以在某種程度上控制交聯(lián)劑的反應(yīng)部位，可以通過交聯(lián)劑反應(yīng)活性部位的疏水性、親水性或電荷來控制反應(yīng)。二、交聯(lián)劑的類型交聯(lián)劑類型同型雙功能試劑異型雙功能試劑可被光活化試劑.可裂解性不可裂解性反應(yīng)基團(tuán)間隔基團(tuán)反應(yīng)基團(tuán)CH3OCNH2CH3OCNH2同型雙功能試劑(CH2)n，長度可變SSN異型雙功能試劑（-S-（CH2）n-）2可被硫醇裂解長度可變OCCHOH（）2可被高碘酸裂解亞氨酯光活化雙功能試劑OHN3CNCF3OCNOC Cl能與胺反應(yīng)的基團(tuán)能與巰基反應(yīng)的基團(tuán)（一）同型雙功能試劑交聯(lián)劑兩端具有相同的反應(yīng)活性部分。雙亞氨酯，可與氨基反應(yīng)。兩端間的間隔基團(tuán)是（CH

9、2）nOCNH2(CH2)nClCH3OC CH3NH2Cl若間隔基團(tuán)含有二硫橋，則成為可裂解同型雙功能試劑。CSCH3ONH2Cl(CH2)2CSCH3ONH2Cl(CH2)2所有同型雙功能試劑都對氨基有專一性，但戊二醛例外，它除了與氨基反應(yīng)外，還可與羥基反應(yīng)。雙亞氨酸酯（非裂解）二甲基-3，3-二硫代-雙丙基亞氨酯（可裂解）（二）異型雙功能試劑這類試劑的一端與氨基作用，另一端與巰基側(cè)鏈作用，但用碳二亞胺時，另一端反應(yīng)基團(tuán)是羧基。這類交聯(lián)劑的一端含有氨基反應(yīng)部分，N-羥琥珀酰亞胺，另一端含有巰基反應(yīng)部分，馬來酰亞胺或聯(lián)硫基。COON(CH2)3OO2N-羥琥珀酰亞胺辛二酸酯（非裂解）CSO(

10、CH2)2SONOONN-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫代)丙酸酯（三）可被光活化的試劑這類試劑是異型雙功能試劑的擴(kuò)展。當(dāng)交聯(lián)劑一端的反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)作用之后，經(jīng)光照另一端則產(chǎn)生一個反應(yīng)活性部分，這部分即可是碳烯，也可是氮烯。這類交聯(lián)劑一端一般含有能與氨基或巰基反應(yīng)的基團(tuán)，而另一端則含有對光敏感的基團(tuán)。三、交聯(lián)劑的使用蛋白質(zhì)與交聯(lián)劑的反應(yīng)直接有助于蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性交聯(lián)劑可用來測定蛋白質(zhì)亞基的量能形成分子間的交聯(lián)鍵，使蛋白質(zhì)對變性穩(wěn)定。兩種酶通過交聯(lián)形成雜化酶。交聯(lián)可提高酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性?？蓽y定齊聚體蛋白質(zhì)的分子量和亞基數(shù)目。測定蛋白質(zhì)上殘基間的距離。測定酶的活性部位。第五節(jié) 親和標(biāo)記親和標(biāo)記

11、：部位專一性標(biāo)記，是利用酶和底物的親和性，使用與酶底物類似的修飾劑，對酶活性部位上的氨基酸殘基進(jìn)行共價標(biāo)記。親和試劑作為底物類似物的標(biāo)準(zhǔn)：1.在使蛋白質(zhì)不可逆失活以前，親和試劑要與酶形成可逆復(fù)合物；2.親和試劑的修飾程度是有限的；3.沒有反應(yīng)性的競爭性配位體的存在，應(yīng)減弱親和試劑的反應(yīng)速 度；4.親和試劑的體積不能太大，否則產(chǎn)生空間位阻；5.修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定，便于表征和定量。親和試劑分類內(nèi)生親和試劑外生親和試劑一、內(nèi)生親和試劑IO4-+ENZ-(CH2)4-NH2NaBH4O-ATP與氨基反應(yīng)過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與氨基側(cè)鏈的可能反應(yīng)希夫堿化合物OOOHOHNH2NNNNCH2OPO

12、OOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2HHORC(CH2)4ENZCNOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZCH2H2CHN+ENZ-(CH2)4-NH2+ENZ-CH2SHO-ATPO-ATP與巰基反應(yīng)與氨基反應(yīng)過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與賴氨酸側(cè)鏈的可能反應(yīng)過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與巰基側(cè)鏈的可能反應(yīng)嗎啉型加合物OONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZNHOONH2NNNNCH2HOO

13、RCCH2SCHHENZ缺點(diǎn)：產(chǎn)生的二醛幾乎全部與賴氨酸側(cè)鏈反應(yīng)，不能與更多類型側(cè)鏈反應(yīng)。嘌呤核苷酸的烷基鹵化衍生物也可看作是親和試劑，各種親和側(cè)鏈如Cys、His、Lys、Met等能與試劑上的鹵原子反應(yīng)。OPOOPOOOOPOOOHCH2AdenOCH2OPOOOOPCH2AdenClOCH2OOOPCH2AdenClCH2ATP腺苷-5-氯代甲烷焦磷酸酯腺苷-5-(-磷酸氯乙酯）Aden-為腺苷ATP的烷基鹵化衍生物由于這兩種試劑的結(jié)構(gòu)與ATP相似，才看作是內(nèi)生親和試劑。二、外生親和試劑（一）將鹵代烷基衍生物通過腺嘌呤的N-6連到腺嘌呤上，則可形成有效的外生親和試劑。N-6-對-溴乙酰胺-

14、芐基-ADP（二）通過腺嘌呤核苷酸的磷酸基可加入另一類反應(yīng)基團(tuán)。OOOOOPOCH2AdenSF腺苷-5-(對-氟磺酰苯酰磷酸）這類試劑對賴氨酸和酪氨酸的反應(yīng)性很強(qiáng)。合成具有兩個反應(yīng)基的嘌呤核苷酸衍生物，它既含鹵代烷基部分又含二羰丁基部分，不僅對能與鹵代烷反應(yīng)的側(cè)鏈有專一性，還對精氨酸殘基有專一性。OOPOOOHNNNNCH2ONHCOCH2BrOHCHNH（三）光親和試劑是一類特殊的外生親和試劑。優(yōu)點(diǎn)：光活化產(chǎn)生的自由基（碳烯或氮烯）能無選擇地與各類側(cè)鏈反應(yīng)。8-疊氮腺苷三磷酸芳基疊氮-丙氨酸NAD試劑中的光親和基團(tuán)是通過核糖的羥基連接的。ONH2OOPOOOPOCOOHNH2NNNNO(C

15、H2)2COOHNHN3NO2NOOHOHNH2OOOOPOOOPOOOOHNNNNCH2OOHN3P疊氮衍生物可看作是內(nèi)生親和試劑，而芳基疊氮衍生物是外生親和試劑。第六節(jié) 蛋白質(zhì)氨基酸的敏化光氧化蛋白質(zhì)的敏化光氧化：當(dāng)敏化劑與蛋白質(zhì)共存時，若用可見光照射，則敏化劑產(chǎn)生化學(xué)變化，使蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化。敏化光氧化需分子氧，而啟動光氧化反應(yīng)的是處于激發(fā)三重態(tài)的敏化劑。敏化光氧化的反應(yīng)機(jī)理，有兩種解釋：1.敏化光氧化并不決定于敏化劑與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。2.蛋白質(zhì)先與三重態(tài)的敏化劑發(fā)生專一性的結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生自由基離子，再與分子氧反應(yīng)，形成蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物。影響光敏化反應(yīng)效率和選擇性的主要因素是敏化劑對蛋白質(zhì)

16、的結(jié)合作用。使用能與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的敏化劑，可以了解某些氨基酸殘基在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象中配置情況，也可測定蛋白質(zhì)中包埋的和暴露的基團(tuán)。第七節(jié) 蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用一、用來測定蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸的數(shù)量常用方法:對氯苯甲酸與巰基作用；三硝基苯磺酸與氨基作用;熒光胺與氨基作用等。二、在蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用（一）控制酶解程度用三氟乙酰法將Lys的-NH2保護(hù)起來變成酶不能水解的產(chǎn)物。通過化學(xué)修飾將Cys轉(zhuǎn)變成S-氨乙酰- Cys通過化學(xué)修飾將Ser轉(zhuǎn)變成S-氨乙酰- Cys例如用胰蛋白酶只水解精氨酸形成的肽鍵。如果要增加胰蛋白酶水解位置。NHCH CONHSSCH2CH2CHNHCONH還原劑胱氨酸

17、NHCH CONHSHCH2半胱氨酸CH2CH2NHNHCH CONHSNH2CH2CH2CH2S-氨乙酰-半胱氨酸基環(huán)乙烯亞胺NHCH CONHOHCH2XClNHCH CONHOXCH2SHNH2CH2CH2絲氨酸基（二）化學(xué)裂解用化學(xué)方法裂解肽鍵是常用方法。普遍采用的是用溴化氰專一裂解Met的羧基所形成的肽鍵。用硫醇、硼氫化鈉、亞硫酸鹽等裂解蛋白質(zhì)中的二硫鍵。三、在雜化實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用催化亞基Cn四硝基甲烷硝化亞基（活力保持8090%）磷酸吡哆醛吡哆醛化亞基四氫鄰苯二甲酸酐?；呋瘉喕呋瘉喕鵆n調(diào)節(jié)亞基R修飾亞基Ct重組CnRCnCnRCtCtRCt（活力喪失90%）重組分子（雜化分子）C

18、H3ENZSICH2COO-+pH=28.5CH3CH2ENZ+SCOO-I-NH2ENZICH2COO-+pH=8.5甲硫氨酸HNCH2HENZ+COO-I-+（二）2類試劑能與巰基形成對酸穩(wěn)定的衍生物，而與其它基團(tuán)形成的產(chǎn)物則對酸不穩(wěn)定。HENZSCH3CH2ONO+pH 5CCH3CHCCH2ONHENZCOSH副反應(yīng)：NH2ENZCH3CH2ONO+pH 7CCH3CHNCCH2HONHENZCOH半胱氨酸（三）3類試劑對巰基專一性最強(qiáng)。常用的是對氯汞苯甲酸，S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是對氯汞苯甲酸的衍生物，也可與巰基反應(yīng)。馬來酸酐光活化雙功能試劑OHN3CNCF3OCNO

19、C Cl能與胺反應(yīng)的基團(tuán)能與巰基反應(yīng)的基團(tuán)（一）同型雙功能試劑交聯(lián)劑兩端具有相同的反應(yīng)活性部分。雙亞氨酯，可與氨基反應(yīng)。兩端間的間隔基團(tuán)是（CH2）nOCNH2(CH2)nClCH3OC CH3NH2Cl若間隔基團(tuán)含有二硫橋，則成為可裂解同型雙功能試劑。CSCH3ONH2Cl(CH2)2CSCH3ONH2Cl(CH2)2所有同型雙功能試劑都對氨基有專一性，但戊二醛例外，它除了與氨基反應(yīng)外，還可與羥基反應(yīng)。雙亞氨酸酯（非裂解）二甲基-3，3-二硫代-雙丙基亞氨酯（可裂解）這類交聯(lián)劑一端一般含有能與氨基或巰基反應(yīng)的基團(tuán)，而另一端則含有對光敏感的基團(tuán)。三、交聯(lián)劑的使用蛋白質(zhì)與交聯(lián)劑的反應(yīng)直接有助于蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性交聯(lián)劑可用來測定蛋白質(zhì)亞基的量能形成分子間的交聯(lián)鍵，使蛋白質(zhì)對變性穩(wěn)定。兩種酶通過交聯(lián)形成雜化酶。交聯(lián)可提高酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性?？蓽y定齊聚體蛋白質(zhì)的分子量和亞基數(shù)目。測定蛋白質(zhì)