高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測(cè)定演示教學(xué)

1、高效液相色譜儀的定性定量分析未知樣品中苯甲酸含量的測(cè)定 二。實(shí)驗(yàn)原理：二。實(shí)驗(yàn)原理： 高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，（的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，（經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法使用粗粒使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長(zhǎng)玻璃管柱內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力多孔固定相，裝填在大口徑、長(zhǎng)玻璃管柱內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度極其緩慢，柱入流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度極其緩慢，柱入口壓力低，僅有低的柱效，分析時(shí)間長(zhǎng)；口壓力低，僅有低的柱效，分析時(shí)間長(zhǎng)；氣相色譜氣相色譜原

2、理類似，原理類似，流動(dòng)相為氣體，只能分離小分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，配流動(dòng)相為氣體，只能分離小分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物。）彌補(bǔ)了經(jīng)典液相色合程序升溫可分析高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物。）彌補(bǔ)了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜的缺點(diǎn)。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小譜法和氣相色譜的缺點(diǎn)。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過(guò)高壓輸液泵進(jìn)入高壓的色譜口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過(guò)高壓輸液泵進(jìn)入高壓的色譜柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短時(shí)間內(nèi)柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得高的分離能力。獲得高的分離能力?？煞治?/p>

3、低分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，可分析低分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，更多適用于分析中、高分子量、高沸點(diǎn)及熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化更多適用于分析中、高分子量、高沸點(diǎn)及熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物合物。由于由于80%的有機(jī)化合物都可以用高效液相色譜法分析的有機(jī)化合物都可以用高效液相色譜法分析，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境檢測(cè)、石油化工等行業(yè)。環(huán)境檢測(cè)、石油化工等行業(yè)。 根據(jù)使用的根據(jù)使用的固定相及流動(dòng)相固定相及流動(dòng)相的極性不同，分為的極性不同，分為正相正相液相色譜和反相液相色譜液相色譜和反相液相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極：固定相為極

4、性，流動(dòng)相為非極性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧化鎂，流動(dòng)相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動(dòng)化鎂，流動(dòng)相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動(dòng)相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳粒和氧化鋁，流動(dòng)相為水、醇等）。粒和氧化鋁，流動(dòng)相為水、醇等）。（1）定性分析：）定性分析： 液相色譜法可以分離有機(jī)化合物，在分配色譜中，組分在液相色譜法可以分離有機(jī)化合物，在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度取決于它們?cè)诠潭ㄏ嗪土鲃?dòng)相中的分配系色譜柱上的保留程度取決于它們?cè)诠潭ㄏ?/p>

5、和流動(dòng)相中的分配系數(shù)數(shù)K：K=（組分在固定相中的濃度）（組分在固定相中的濃度）/（組分在流動(dòng)相中的濃度）（組分在流動(dòng)相中的濃度） 顯然，顯然，K值越大，組分在固定相上的停留時(shí)間越長(zhǎng)，容易值越大，組分在固定相上的停留時(shí)間越長(zhǎng)，容易理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)，理解：溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)，K值越大停留的時(shí)間也越長(zhǎng)，值越大停留的時(shí)間也越長(zhǎng)，K值值越小，停留的時(shí)間也越短，由于組分在固定相的越小，停留的時(shí)間也越短，由于組分在固定相的K不同，就會(huì)不同，就會(huì)出現(xiàn)差速遷移，從而達(dá)到分離的目的。出現(xiàn)差速遷移，從而達(dá)到分離的目的。 一般情況下，當(dāng)一般情況下，當(dāng)外界條件及方法外界條件及方法確定，溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱時(shí)確定，溶質(zhì)流經(jīng)

6、色譜柱時(shí)，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時(shí)間不一致，在檢測(cè)器上，不同分配系數(shù)的物質(zhì)流出色譜柱的時(shí)間不一致，在檢測(cè)器上得到響應(yīng)，表現(xiàn)為出峰時(shí)間不一致，同一組分（得到響應(yīng)，表現(xiàn)為出峰時(shí)間不一致，同一組分（K值固定），值固定），保留時(shí)間保留時(shí)間To一致，一致，根據(jù)這個(gè)特性，可以分離不同的有機(jī)化合根據(jù)這個(gè)特性，可以分離不同的有機(jī)化合物物。（2）定量分析（）定量分析（ESTD法）：法）： 用高效液相色譜法測(cè)定未知樣品中的苯甲酸含量，將用高效液相色譜法測(cè)定未知樣品中的苯甲酸含量，將已配置濃度不同的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液也進(jìn)入色譜系統(tǒng)，已配置濃度不同的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液也進(jìn)入色譜系統(tǒng)，繪制繪制濃度濃度峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如流速和泵的壓力在整個(gè)實(shí)如流速和泵的壓力在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是恒定的，測(cè)定它們?cè)谏V圖上的保留時(shí)間驗(yàn)過(guò)程中是恒定的，測(cè)定它們?cè)谏V圖上的保留時(shí)間 （T0或保留距離）和峰面積或保留距離）和峰面積A后，可直接用后，可直接用 T0 定性，用峰定性，用峰面積作為定量測(cè)定的參數(shù)，面積作為定量測(cè)定的參數(shù)，注入未知樣品后，得知未知樣注入未知樣品后，得知未知樣品的峰面積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量品的峰面積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知樣中的苯甲酸的含量。三儀器和試劑三儀器和試劑：1 高效液相色譜儀，高效液相色譜儀，VWD（254nm）檢測(cè)儀。）檢測(cè)儀。2色譜柱：色譜柱：C183超聲波發(fā)生器

8、或水泵超聲波發(fā)生器或水泵(用于過(guò)濾或排氣用于過(guò)濾或排氣)4注射器：注射器：50微升微升5容量瓶：容量瓶：100ml若干若干6移液管：移液管：2ml、4ml、8ml7流動(dòng)相：甲醇：乙酸流動(dòng)相：甲醇：乙酸+乙酸氨（乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制備前，先調(diào)節(jié)水制備前，先調(diào)節(jié)水(用酸或緩沖鹽用酸或緩沖鹽)的的PH=3.5，進(jìn)入系統(tǒng)，進(jìn)入系統(tǒng)色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。色譜前，用超聲波發(fā)生器或水泵脫氣。四實(shí)驗(yàn)步驟四實(shí)驗(yàn)步驟：（ESTD法）1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置：準(zhǔn)確量?。簻?zhǔn)確量取0.144克苯甲酸鈉試劑克苯甲酸鈉試劑，用純水或去離子水溶解，定容到，用純水或去離子水溶解，定容到

9、100毫升，濃度為毫升，濃度為1.44mg/ml. 分別取此標(biāo)準(zhǔn)液分別取此標(biāo)準(zhǔn)液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀稀釋為釋為10 ml，則濃度分別為，則濃度分別為0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。2 打開計(jì)算機(jī)，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的打開計(jì)算機(jī)，開儀器，穩(wěn)定后，打開桌面的ONLINE工作站。工作站。 設(shè)定方法設(shè)定方法：設(shè)置泵的流速為：設(shè)置泵的流速為1ml/min，柱溫為室溫（，柱溫為室溫（40度左右），停止時(shí)間為度左右），停止時(shí)間為4min，流動(dòng)相比例（甲醇：水，流動(dòng)相比例（甲醇：水=60；40），當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)色譜柱

10、約），當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)色譜柱約5-10min，記錄儀上基，記錄儀上基線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣。線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣。3 進(jìn)樣：進(jìn)樣閥進(jìn)樣：進(jìn)樣閥放在裝載的位置上，用注射器取放在裝載的位置上，用注射器取25微升微升濃度最低的標(biāo)準(zhǔn)樣（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多濃度最低的標(biāo)準(zhǔn)樣（比進(jìn)樣閥上的定量環(huán)多5-10微升以上微升以上），注入進(jìn)樣閥中。），注入進(jìn)樣閥中。4進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位，同時(shí)按進(jìn)樣按扭，工作站進(jìn)樣閥從裝載轉(zhuǎn)向進(jìn)樣位，同時(shí)按進(jìn)樣按扭，工作站開始記錄并出圖開始記錄并出圖11。5苯甲酸的色譜峰出完后，按照苯甲酸的色譜峰出完后，按照4-5步驟連續(xù)操作四次，步驟連續(xù)操作四次，獲得從最低濃度到最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)試液的五張

11、色譜圖，分獲得從最低濃度到最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)試液的五張色譜圖，分別為別為11，12，13，14，15（15為流動(dòng)相進(jìn)樣，設(shè)濃度為為流動(dòng)相進(jìn)樣，設(shè)濃度為0 mg/ml）。）。6按照按照4-5步驟取步驟取25微升的未知樣品，進(jìn)樣，出譜圖微升的未知樣品，進(jìn)樣，出譜圖W1。六數(shù)據(jù)分析六數(shù)據(jù)分析1. 1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的保留時(shí)間，找到并標(biāo)出飲根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的保留時(shí)間，找到并標(biāo)出飲料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。料色譜圖中的苯甲酸的色譜峰位置。2根據(jù)圖根據(jù)圖11，12，13，14，15的濃度和峰面積，作苯的濃度和峰面積，作苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知中苯甲酸的濃在標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知中苯甲酸的濃度。度。七問(wèn)題討論七問(wèn)題討論1用框架圖畫出用框架圖畫出HP1100液相色譜儀的構(gòu)造流程。液相色譜儀的構(gòu)造流程。2用正相色譜柱可以進(jìn)行苯甲酸的定性和定量分