實(shí)驗(yàn) -薄層色譜法

1、2022-4-121實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 3 薄層色譜法薄層色譜法2022-4-1221. 1. 了解色譜分離的原理及其應(yīng)用。了解色譜分離的原理及其應(yīng)用。2. 2. 初步掌握薄層色譜的操作技能。初步掌握薄層色譜的操作技能。目的和要求目的和要求2022-4-123色譜法色譜法概述概述 19381938年俄國(guó)人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離年俄國(guó)人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。一種天然藥物。19651965年德國(guó)化學(xué)家出版了年德國(guó)化學(xué)家出版了“薄層色薄層色譜法譜法”一書(shū)，推動(dòng)了這一技術(shù)的發(fā)展。一書(shū)，推動(dòng)了這一技術(shù)的發(fā)展。 2022-4-124 色譜法（色譜法（ChromatographyChroma

2、tography）亦稱色層法、層）亦稱色層法、層析法等。色譜法是分離、純化和鑒定有機(jī)化合物的析法等。色譜法是分離、純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。重要方法之一。 色譜法的基本原理是色譜法的基本原理是利用混合物各組分在某一利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親（分配）的不同，或其親和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進(jìn)行反和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用，從而使各組分分離。復(fù)的吸附或分配作用，從而使各組分分離。色譜法原理色譜法原理2022-4-1251. 1. 按固定相所處的狀態(tài)分類按固定相所處的狀態(tài)分類 ：

3、薄層薄層色譜（色譜（Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography） 柱色譜柱色譜 （Column ChromatographyColumn Chromatography） 紙色譜紙色譜 （Paper ChromatographyPaper Chromatography） 2. 2. 按分離機(jī)理分類：按分離機(jī)理分類： 吸附色譜（吸附色譜（Adsorption ChromatographyAdsorption Chromatography） 分配色譜（分配色譜（Partition ChromatographyPartition Chromat

4、ography） 離子交換色譜（離子交換色譜（I ECI EC） 凝膠色譜（凝膠色譜（GPCGPC） v 分分 類類2022-4-1266如上色譜都屬吸附色譜類型，用固體吸附劑作固如上色譜都屬吸附色譜類型，用固體吸附劑作固定相，以不同溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分定相，以不同溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離在吸附劑上吸附性能的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離儀器分析實(shí)驗(yàn) 高效液相色譜高效液相色譜 (HPLC) (HPLC) 氣相色譜氣相色譜 (GC)(GC)2022-4-127色譜法三要素色譜法三要素吸附劑（固定相）：吸附劑（固定相）： 用于與樣品發(fā)生吸附作用的固定不動(dòng)的用于與樣

5、品發(fā)生吸附作用的固定不動(dòng)的 物質(zhì)。在混合物樣品流經(jīng)固定相的過(guò)程物質(zhì)。在混合物樣品流經(jīng)固定相的過(guò)程 中，由于各組分與固定相吸附力的不同，中，由于各組分與固定相吸附力的不同， 就產(chǎn)生了速度的差異，從而將混合物中就產(chǎn)生了速度的差異，從而將混合物中 的各組分分開(kāi)。的各組分分開(kāi)。2022-4-128 氧化鋁（氧化鋁（aluminaalumina） 氧化鋁的吸附活性來(lái)源于鋁原子上未成氧化鋁的吸附活性來(lái)源于鋁原子上未成鍵電子對(duì)。氧化鋁的活性與含水量有關(guān)，含鍵電子對(duì)。氧化鋁的活性與含水量有關(guān)，含水量越低，活性越大，吸附力越強(qiáng)。無(wú)水氧水量越低，活性越大，吸附力越強(qiáng)。無(wú)水氧化鋁吸附活性特別強(qiáng)。根據(jù)氧化鋁的含水量化

6、鋁吸附活性特別強(qiáng)。根據(jù)氧化鋁的含水量可將氧化鋁的活性分為五級(jí)可將氧化鋁的活性分為五級(jí) 。吸附色譜三要素吸附色譜三要素吸附劑吸附劑2022-4-129* * 酸性氧化鋁酸性氧化鋁（pHpH5-45-4），），適用于分離酸性化合適用于分離酸性化合物物 和對(duì)酸穩(wěn)定的中性化合物，如酚類物質(zhì)和某些氨和對(duì)酸穩(wěn)定的中性化合物，如酚類物質(zhì)和某些氨 基酸類等?；犷惖?。* * 中性氧化鋁中性氧化鋁（pHpH7.57.5），），適用與分離生物堿、適用與分離生物堿、揮揮 發(fā)油、萜類、甾類、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定甙發(fā)油、萜類、甾類、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定甙 類、酯、內(nèi)酯等化合物。凡是能用酸性或堿性氧類、酯、內(nèi)酯等化合

7、物。凡是能用酸性或堿性氧 化鋁層析分離的物質(zhì)，中性氧化鋁也都適用?；X層析分離的物質(zhì)，中性氧化鋁也都適用。* * 堿性氧化鋁堿性氧化鋁（pHpH9-109-10），），適用于堿性，如生物適用于堿性，如生物 堿和中性化合物的分離。堿和中性化合物的分離。 吸附色譜三要素吸附色譜三要素吸附劑吸附劑2022-4-1210 硅膠硅膠silica gel silica gel 它的吸附性來(lái)源于它的吸附性來(lái)源于硅膠氧原子上未成鍵硅膠氧原子上未成鍵的電子對(duì)和可以形成的電子對(duì)和可以形成氫鍵的羥基。羥基有氫鍵的羥基。羥基有結(jié)合型（結(jié)合型（）、活性）、活性型（型（）和游離型）和游離型（）三種）三種吸附色譜三要素吸附

8、色譜三要素吸附劑吸附劑2022-4-1211活性氧化鋁含水量（）硅膠含水量（）0 00 03 35 58 815151010252515153838吸附色譜三要素吸附色譜三要素吸附劑吸附劑2022-4-1212洗脫劑（流動(dòng)相）：洗脫劑（流動(dòng)相）： 也稱展開(kāi)劑，在色譜過(guò)程中起到將吸附也稱展開(kāi)劑，在色譜過(guò)程中起到將吸附 在固定相上的樣品洗脫的作用。在固定相上的樣品洗脫的作用。乙酸乙酸 吡啶吡啶 水水 醇類（甲醇醇類（甲醇 乙醇乙醇 正丙醇）正丙醇） 丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 二氯甲烷二氯甲烷 甲苯甲苯 環(huán)己烷環(huán)己烷 正正己烷己烷 石油醚石油醚 * * 從前到后從前到后- -洗

9、脫能力降低。洗脫能力降低。2022-4-1213 試樣：試樣： 在給定的條件下，各個(gè)成分的分離情況，在給定的條件下，各個(gè)成分的分離情況，與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，對(duì)極性吸附與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，對(duì)極性吸附劑而言，被分離物質(zhì)的極性越大，兩者吸附作劑而言，被分離物質(zhì)的極性越大，兩者吸附作用也越強(qiáng)。具有極性基團(tuán)的化合物，其吸附能用也越強(qiáng)。具有極性基團(tuán)的化合物，其吸附能力按下列順序增加：力按下列順序增加： Cl, Br, I C=C OCH3 CO2R C=O , =O , CHO -SH- -NH2 -OH -CO2H 結(jié)論：若樣品極性越小，或流動(dòng)相極性越大，樣品結(jié)論：若樣品極性越小，或

10、流動(dòng)相極性越大，樣品 在固定相上的移動(dòng)速度則越快。在固定相上的移動(dòng)速度則越快。2022-4-1214在在吸附層析中吸附層析中，試樣，試樣、洗脫劑和吸附劑三者、洗脫劑和吸附劑三者關(guān)關(guān)系系。它們。它們?nèi)呷叩年P(guān)系如下圖。的關(guān)系如下圖。StahlStahl簡(jiǎn)圖簡(jiǎn)圖 （1 1）離）離化合物的極性化合物的極性；（2 2）吸附劑）吸附劑的的活度；活度；（3 3）展開(kāi)劑的極性。）展開(kāi)劑的極性。若若將這三個(gè)因素各自將這三個(gè)因素各自固定在固定在圓周的圓周的三分之一，轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤(pán)三分之一，轉(zhuǎn)動(dòng)圓盤(pán)正中正中的三角形，的三角形，如果角如果角A A指向極性指向極性物質(zhì)物質(zhì)，則角，則角B B指向指向活度小的吸附劑活度小的吸

11、附劑，角，角C C就指向選用極就指向選用極性展開(kāi)劑性展開(kāi)劑；A, B, C, 處則是合理的處則是合理的選擇選擇組合。組合。15有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用* * 分離混合物：分離混合物： 一些結(jié)構(gòu)類似、理化性質(zhì)也相似的化合物組成的一些結(jié)構(gòu)類似、理化性質(zhì)也相似的化合物組成的混合物，一般應(yīng)用化學(xué)方法分離很困難，但應(yīng)用色譜混合物，一般應(yīng)用化學(xué)方法分離很困難，但應(yīng)用色譜法分離，有時(shí)可得到滿意的結(jié)果。法分離，有時(shí)可得到滿意的結(jié)果。* * 精制提純化合物：精制提純化合物： 有機(jī)化合物中含有少量結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)，不易除有機(jī)化合物中含有少量結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)，不易除去，可利用色譜法分離以除去雜質(zhì)，得到純品。去，

12、可利用色譜法分離以除去雜質(zhì)，得到純品。2022-4-1216* * 鑒定化合物：鑒定化合物： 在條件完全一致的情況，純粹的化合物在薄層在條件完全一致的情況，純粹的化合物在薄層色譜呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（色譜呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（R Rf f值），所值），所以利用色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性以利用色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。* * 跟蹤一些化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程：跟蹤一些化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程： 可以利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點(diǎn)的逐可以利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點(diǎn)的逐步消失，以證明反應(yīng)完成與否。步消失，以證明反應(yīng)完

13、成與否。2022-4-1217薄層色譜薄層色譜 薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固- -液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于適用于少量樣品少量樣品（幾到幾微克，甚至（幾到幾微克，甚至0.010.01微克）的分離；微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，又可用來(lái)另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，又可用來(lái)精制樣品精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫

14、度易發(fā)生，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法還變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來(lái)可用來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng)跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行及進(jìn)行柱色譜之前的一種柱色譜之前的一種“預(yù)試預(yù)試”。2022-4-1218一、實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)步驟1.1. 薄層板的制備薄層板的制備2.2. 展開(kāi)劑的選擇展開(kāi)劑的選擇3.3. 點(diǎn)樣點(diǎn)樣4.4. 展開(kāi)展開(kāi)5.5. 顯色顯色6.6. 比移值比移值干鋪法干鋪法傾注法傾注法紫外光顯色法紫外光顯色法碘蒸氣顯色法碘蒸氣顯色法試劑顯色法試劑顯色法2022-4-12191. 1. 制薄層板制薄層板硬板制備：硬板制備：50

15、mL50mL燒杯中放置燒杯中放置10g10g硅膠硅膠GFGF254 254 ，逐漸加入，逐漸加入5%5%羧甲基纖維素鈉（羧甲基纖維素鈉（CMCCMC）水溶液）水溶液7mL7mL，調(diào)成均勻的糊狀。，調(diào)成均勻的糊狀。將其涂于三片玻璃板（將其涂于三片玻璃板（7.57.52.5 cm)2.5 cm)上，室溫放置半小上，室溫放置半小時(shí)后，放入烘箱中在時(shí)后，放入烘箱中在110110恒溫半小時(shí)，即制得硬板。恒溫半小時(shí)，即制得硬板。202. 2. 點(diǎn)樣點(diǎn)樣樣品準(zhǔn)備：樣品準(zhǔn)備：1. 偶氮苯的純化偶氮苯的純化 樣品：樣品： 1% 偶氮苯溶液；偶氮苯溶液； 展開(kāi)劑：展開(kāi)劑：9:1 石油醚石油醚/乙酸乙酯乙酸乙酯 1

16、:3 石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯2. 蘇丹蘇丹的純化的純化 樣品：樣品： 1%蘇丹蘇丹的溶液；的溶液； 展開(kāi)劑：展開(kāi)劑：9:1 石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯 1:3石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯3. 混合樣品的分離混合樣品的分離 樣品：樣品： 1%偶氮苯和偶氮苯和1%蘇丹蘇丹溶液混合樣品溶液混合樣品 展開(kāi)劑：展開(kāi)劑：9: 1石油醚石油醚/乙酸乙酯乙酸乙酯2022-4-1221性性和和u小極性。小極性。2022-4-1222n選洗脫劑可利用微量圓選洗脫劑可利用微量圓環(huán)技術(shù)；環(huán)技術(shù)；n配制配制樣品的樣品的溶劑具有揮溶劑具有揮發(fā)性和小極性，以免發(fā)性和小極性，以免 斑點(diǎn)斑點(diǎn)擴(kuò)展擴(kuò)展, ,不利于不

17、利于分離分離; ;n洗脫劑的高度不超過(guò)洗脫劑的高度不超過(guò)0.5cm,0.5cm,以免樣品被洗脫以免樣品被洗脫劑擴(kuò)散；劑擴(kuò)散； 微量圓環(huán)技術(shù)微量圓環(huán)技術(shù) 1 1 用環(huán)己烷展開(kāi)用環(huán)己烷展開(kāi) 2 2 用苯展開(kāi)用苯展開(kāi) 3 3 用氯仿展開(kāi)用氯仿展開(kāi)2022-4-1223展開(kāi)槽 普通展開(kāi)槽普通展開(kāi)槽 雙底展開(kāi)槽雙底展開(kāi)槽2022-4-1224 多次展開(kāi)多次展開(kāi) 一次展開(kāi)未達(dá)滿意分離時(shí)，可將一次展開(kāi)未達(dá)滿意分離時(shí)，可將薄層板干薄層板干 燥后再次用同一種溶劑展開(kāi)，可重復(fù)多燥后再次用同一種溶劑展開(kāi)，可重復(fù)多次，直到混合物分離為止。次，直到混合物分離為止。 梯度展開(kāi)梯度展開(kāi) 混合物性質(zhì)差別較大時(shí)，一種流混合物性

18、質(zhì)差別較大時(shí)，一種流動(dòng)相不能有效分離時(shí)，可采用不同溶劑依次展開(kāi)不動(dòng)相不能有效分離時(shí)，可采用不同溶劑依次展開(kāi)不同距離。同距離。 二維展開(kāi)二維展開(kāi)在兩個(gè)垂直的方向上進(jìn)行展開(kāi)。將在兩個(gè)垂直的方向上進(jìn)行展開(kāi)。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個(gè)角上，展開(kāi)適當(dāng)距離后，揮樣品點(diǎn)在薄層板的一個(gè)角上，展開(kāi)適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開(kāi)方向成干溶劑，再將薄層板以與原展開(kāi)方向成 90 90 的方的方向進(jìn)行展開(kāi)。向進(jìn)行展開(kāi)。2022-4-1225原點(diǎn)原點(diǎn)1 12 22022-4-1226薄層色譜示意圖薄層色譜示意圖12-132-22-32-42022-4-12274.4.顯色及數(shù)據(jù)記錄顯色及數(shù)據(jù)記錄2022-4-121. 1. 板點(diǎn)樣需很輕，否則固定相會(huì)粘到點(diǎn)樣管下方。板點(diǎn)樣需很輕，否則固定相會(huì)粘到點(diǎn)樣管下方。2. 2. 一根點(diǎn)樣管只能點(diǎn)一種樣品，否則有交叉污染。一根點(diǎn)樣管只能點(diǎn)一種樣品，否則有交叉污染。3.3. 樣品點(diǎn)直徑應(yīng)不超過(guò)樣品點(diǎn)直徑應(yīng)不超過(guò) 2 mm2 mm，樣品點(diǎn)決不能浸到展開(kāi)，樣品點(diǎn)決不能浸到展開(kāi)劑中。劑中。4. 4. 展開(kāi)劑離薄層板上緣約展開(kāi)劑離薄層板上緣