生物催化技術

1、生物催化技術摘要：本文主要探討生物催化劑的種類、生物催化酶的制備、表征、應用等方面。其中固定化酶有許多粗酶液沒有的特點，但制備固定酶首先要經(jīng)過大量復雜的分離、純化工作，而且一種固定化酶只能用于特定的單步反應，以及對現(xiàn)代生物催化技術的發(fā)展及研究。關鍵詞：生物催化劑；性質(zhì)；用途；發(fā)展引言：生物催化劑是游離的或固定的細胞或酶的總稱，它們在生物反應中起著催化劑的作用。生物催化是利用生物催化劑，改變（通常是加速）化學反應速率，合成有機化學品和藥物制品。生物催化涉及三個學科的不同部分：化學中的生物化學和有機化學；生物學中的微生物學、分子生物學和酶學；化學工程學中的催化、傳遞工程和反應工程學。人類很早就知道

2、利用酶和微生物細胞作為生物催化劑進行生物催化已有幾千年歷史，早已發(fā)明了麥芽制曲釀酒工藝，古埃及和古代中國都有歷史記載。近現(xiàn)代認識酶是與發(fā)酵和消化現(xiàn)象聯(lián)系在一起的。后來創(chuàng)造了“酶”這一術語以表述催化活性，近代科學技術對酶的認識研究，成為現(xiàn)代酶學與生物催化研究的基礎?，F(xiàn)代科學技術以及化工行業(yè)的不斷發(fā)展，對于催化劑的要求越來越高，人們不斷探索新的催化技術以滿足不發(fā)展的化工行業(yè)的需求。與化學工業(yè)相反，生物催化技術工業(yè)是產(chǎn)銷量不大的行業(yè)，主要應用與制藥領域及少數(shù)的化工行業(yè)及視頻行業(yè)。生物催化技術對化學工業(yè)的影響主要是可再生資源的生物加工。自生物技術誕生之日起，人們就一直致力于把它應用到工業(yè)生產(chǎn)當中去。工

3、業(yè)生物催化技術是生物技術應用中一個新興和關鍵的領域。生物催化技術首先從和它聯(lián)系做緊密的醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)開始，逐漸涉及到化工、材料等行業(yè)，并通過它們影響社會生產(chǎn)、生活的各個方面。美國21實際發(fā)展規(guī)劃中預計，到2020年，通過生物催化技術，將實現(xiàn)降低化學工業(yè)原料消耗、水資源消耗、能量消耗30%,減少污染物的排放和污染擴散以蛋白質(zhì)酶的工程應用為核心的工業(yè)生物催化技術，被認為是生物技術繼生物醫(yī)藥和轉基因植物之后的第三次浪潮。它的發(fā)展與應用將對人類的工業(yè)化學過程帶來根本的變革。工業(yè)生物催化的興起與以下的兩個關鍵技術因素有密切的關系：(1)蛋白質(zhì)定向進化技術的出現(xiàn)，(2)基因組學和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展。探討了工業(yè)生

4、物催化技術的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，并對我國如何發(fā)展該領域的基礎和應用研究提出一些見解。1 .生物催化劑的種類及性質(zhì)1.1 生物催化劑的種類：從酶的作用和功能的發(fā)現(xiàn)過程中了解到，人們最早使用的是游離的細胞活體，即使用這些細胞中的酶作為生物催化劑；在此基礎上考慮將該酶蛋白質(zhì)從細胞中提取分離出來。比較純的催化劑形態(tài)進行的反應催化，也可以采用固定化技術將酶或細胞固定在惰性固體表面后再使用。因此，固定化細胞和固定化酶又稱固定化催化劑生物催化劑的類別如下：生長細胞、休止細胞、凍干細胞、處理細胞1.2 生物催化劑的性質(zhì)生物催化劑具有催化高效性，催化種類的專一性及反應條件專一性三大基本性質(zhì)。生物催化劑的三大特征決定

5、了生物催化劑的廣泛的用途6。2 .固定化酶的制備方法：2.1 傳統(tǒng)的制備方法：2.1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。顯著特點是：工藝簡便及條件溫和，包括無機、有機高分子材料，吸附過程可同時達到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面。2.1.2 包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物不適用。（1）網(wǎng)格型將酶或包埋

6、在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。（2）微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。2.1.3 結合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結合而使酶固定的方法，叫離子鍵結合法。其間形成化學共價鍵結合的固定化方法叫共價鍵結合法。共價鍵結合法結合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜，反應條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。2.1.4 交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯(lián)，

7、使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結構，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：（1）單獨與酶作用；（2）酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；（3）多功能團試劑與載體反應得到有功能團的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氟酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N,N-乙烯馬來酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點是酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復雜，進行化學修飾時易造成酶失活。2.2 新型的制備方法：2.2.1 共價固定法：酶分子表面存在很多可供利用的化學基團。選擇性地利用酶分子表面遠離活性位點的特定稀有基團

8、(如琉基)進行反應，使該基團與載體上另一基團共價交聯(lián)來同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達到控制其空間取向的目的。Collioud等化學合成一個異雙功能試劑(N-m-3(trifluoromethyl)diazirin-3-ylphenyl4maleimidobutyramide),他們禾用這種雙功能試劑成功地實現(xiàn)了氨基酸、合成肽和抗體Fab片段的定向固定。Stein等通過衍生全氟疊氮基苯疏水交聯(lián)共價固定一種脂鏈細胞蛋白，取得了一致的空間取向。固定后的蛋白質(zhì)分子結合牢固、穩(wěn)定性佳，不能被離子或非離子去污劑清除。2.2.2 氨基酸置換法：利用基因定點突變技術在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個

9、氨基酸分子，通過該氨基酸殘基特殊的側鏈基團控制固定方向。Huang等通過定點突變在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面遠離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys,然后利用Cys殘基上的琉基固定枯草蛋白酶分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。2.2.3 抗體耦聯(lián)法：大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團可以通過賴氨酸的一氨基或末端氨基、天冬氨酸的B-氨基、谷氨酸的y-氨基或末端竣基進行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4

10、A1的Fab片段，抗體酶Fab片段保持了很好的催化活性。抗體分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨基通過縮合反應可實現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肌通過腺鍵結合實現(xiàn)抗體分子的定向固定，與隨機固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時免疫吸附活性也提高了3倍。2.2.4 生物素-親和素親合法：生物素是存在于所有活細胞內(nèi)但含量甚微(<0,0001%)的中性小分子輔酶。親和素是一個含有四個相同亞基的四聚體，每個亞基均含一個生物素結合位點(解離常數(shù)105mol/L)0生物素與親和素或相應細菌中的鏈霉親和素有高專一性的、極強的親和力。這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學、基因工

11、程和蛋白質(zhì)分離等領域中獨特有力的工具。2.2.5 疏水定向固定法：細胞粘著分子(celladhesionmolecules,CAMs)!介導細胞-細胞、細胞-底物粘著、細胞發(fā)育和細胞信號發(fā)生的分子。細胞粘著分子和其它細胞表面分子通常通過疏水作用固定在脂質(zhì)膜上，磷脂錨定是常選擇的方式。接觸位點A糖蛋白是調(diào)節(jié)發(fā)育的細胞粘著分子，產(chǎn)生于多細胞發(fā)生早期，通過形成高親和、EDTA穩(wěn)定的接觸位點介導細胞粘著。接觸位點A糖蛋白可通過神經(jīng)酰胺疏水同定在細胞表面。疏水定向固定可保持蛋白質(zhì)分子結構、生理活性及天然構象。這種通過疏水作用的固定，固定的效率高，固定為非共價，而且固定過程可逆，用去污劑可終止或消除同定應

12、。Stein等用庚基胺修飾竣甲基葡聚糖載體表面的竣基來疏水固定接觸位點A糖蛋白分子，成功地控制了固定位點的空間取向。用mAb7l特異結合來檢測csA的活性狀態(tài)，mAb71結合良好，而mAb353則不能結合。2.2.6 微波/超聲輔助固定化：微波是一種電磁波，波長為0.1100cmo微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場的作用下反復快速取向轉動而摩擦生熱，是從物質(zhì)內(nèi)部開始，瞬時達到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點，包括：加熱迅速、均勻，不需要熱傳導過程，內(nèi)外同時加熱，加熱時間短；加熱質(zhì)量高，營養(yǎng)破壞少；節(jié)能高效；易于控制功能等超聲波是指振動頻率大于20kHz以上的一

13、種縱波，在介質(zhì)中傳播時，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學的變化，從而產(chǎn)生一系列超聲效應，包括熱效應、機械效應、空化效應和化學效應。研究認為，超聲波對液體化學反應速度和產(chǎn)率的影響主要是超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用，超聲可使液體介質(zhì)中形成微泡，其破裂伴隨能量的釋放，可以提高許多化學反應的速度。到目前為止，超聲波技術對物質(zhì)提取，高分子降解，酶解反應等都有很好的促進作用。其中超聲波酶解反應具有高效、廉價、無污染，可提高酶促反應速度和有效成分的產(chǎn)率。3酶固定化原理經(jīng)戊二醛活化的載體具了能與蛋白酶分子的自由氨基反應的基團，及-CHQ經(jīng)過戊二醛活化的載體與酶蛋白分子的反應機理是戊二醛的另一個沒有與為載體相連的-CHO

14、再與酶分子的氨基反應，形成-N=C鍵，從而將酶分子固定在載體上。在加入酶液前必須將過量的戊二醛試劑洗去，因為戊二醛是一種交聯(lián)劑，它能與酶分子交聯(lián)，使酶分子之間形成共價鍵，得到三維網(wǎng)狀交聯(lián)結構。止匕外，戊二醛是蛋白的變性劑，過量的戊二醛本身會使蛋白質(zhì)分子中毒，降低酶的活性，具體反映的機理如圖所示。口日磔加向皿山例4 .生物催化酶的光譜表征：還原型輔酶（NADH）的光譜吸收曲線（吸收峰分別在260nm和340nm）還原型輔酶（NADH）的吸收光譜曲線生化谷丙轉氨酶檢驗試劑的反應原理如下：e酮戊二酸+L-丙氨酸ALT-谷氨酸+丙酮酸（初反應）丙酮酸+NADH+H+LDH-孚瞰+NAD+（主反應）NA

15、DH的氧化速率與樣本中ALT酶活力成正比，NADH在340nm處有特征吸收峰，在340nm處測其吸光度的下降速率即可計算出ALT的活性。5 .固定化酶的應用5.1 醫(yī)藥領域固定化月尿酶：月尿酶是專一性催化尿素水解的酶，應用于尿素生產(chǎn)控制、產(chǎn)品檢驗，也廣泛用于臨床醫(yī)學、醫(yī)學檢驗等，月尿酶的固定化在血液透析中有著極佳的應用前景。固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶，加速體內(nèi)低密度脂蛋白的代謝。人體中的低密度脂蛋白是主要的血漿膽固醇載體，由于其在體內(nèi)代謝緩慢，易形成高血漿膽固醇，以至引起心血管疾病，因此磷酸酯酶的固定化可以應用于心血管疾病的治療。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常

16、用于水解在血液替代品的制備過程中產(chǎn)生的右旋糖酊。5.2 食品行業(yè)：固定化酶應用于食品檢測：固定化酶技術的發(fā)展使生物傳感器也得到相當大的發(fā)展，它不僅使食品成分的高選擇性、快速、低成本分析測定成為可能，而且生物傳感器技術的持續(xù)發(fā)展將很快實現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并可以保證安全可靠及高質(zhì)量的食品。5.3 環(huán)境保護：在環(huán)境監(jiān)測方面，固定化酶也可以用于測定有毒物質(zhì)含量以進行環(huán)境監(jiān)測。楊雪梅等選用硅膠、活性炭、大孔樹脂，在一定條件下用物理吸附法固定蛋白酶，3種載體固定的蛋白酶對含高濃度蛋白質(zhì)的淀粉黃漿廢水進行水解實驗，發(fā)現(xiàn)大孔樹脂對蛋白酶的效果良好，并對含高濃度蛋白質(zhì)的廢水處理效果最好

17、。在廢水處理中，固定化酶也受到了越來越多科學家的關注。生活污水和工業(yè)廢水中有害成分主要是氯酚，將辣根過氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保證其100%的活力，且凈化效果是粗酶的20多倍。5.4 生物傳感器方面的應用：在醫(yī)學領域，生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應快等優(yōu)點發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，在檢測多種細菌、病毒及其毒素等多個方面生物傳感器已有較廣泛應用。比如高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀，其分析精度可以達到0.5%2%,比家用保健類生物傳感器幾乎高一個數(shù)量級，比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%3%這在血糖分析領域是非常重要的6。酶電極現(xiàn)已用于測定各種糖類、抗生素、氨基酸、有

18、機酸、脂肪、醇類、胺類以及尿素、尿酸等。5.5 能源利用：近年來不少學者為了解決能源緊缺問題致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高陽等研究了利用多孔滲水物質(zhì)為載體固定脂肪酶，使其可在低水環(huán)境中合成生物柴油。氫氣作為一種清潔能源已引起人們的關注。有學者利用聚丙烯酰胺凝膠包埋丁酸梭狀芽抱桿菌IFO3847菌株，可以利用葡萄糖生產(chǎn)氫氣，并且穩(wěn)定性好，無需隔氧6 .固定化酶的研究進展固定化酶對提高酶的穩(wěn)定性，拓展酶的應用領域具有非常重要的意義。目前常用固定化方法普遍存在固定化使用試劑和載體成本高，固定化過程中酶的構象受到影響及底物結合部位和活性中心受載體封閉所引起的酶活損失較大，固定化操作過程繁

19、瑣等缺點，限制了固定化酶的產(chǎn)業(yè)化應用。針對當前固定化酶載體和方法的不足，本文采用反相懸浮包埋法合成磁性瓊脂糖微球，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷和亞氨基二乙酸處理使微球帶上螯合基團，經(jīng)吸附銅離子后，制備了磁性瓊脂糖一亞氨基二乙酸（IDA）-Cu2僉屬螯合載體，利用該載體定向固定了木瓜蛋白酶，固定化最適條件為Cu2+1.5X10-2mol/g載體、固定化時間4h、固定化pH7.0、給酶量30mg/g載體。固定化酶的最適反應溫度70C、最適反應pH8.0,固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于溶液酶，固定化酶活力回收為68.4%,且有較好的操作穩(wěn)定性，載體重復使用5次后固定化酶酶活為首次固定化酶79.71%。本文研究了利用金屬

20、螯合載體固定多酚氧化酶時，固定化酶的性質(zhì)。得出固定化酶的最適反應溫度為50C,最適反應pH值7.0,固定化酶的酸堿耐受性明顯好于溶液酶，固定化酶反復使用6次，酶活仍保留50%左右，固定化載體可以反復使用5次，仍保持良好的性能。在使用金屬螯合載體固定化酶時，固定化反應條件溫和，對酶的高級結構影響小，酶活回收高；固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高；載體的再生、酶的固定化過程操作簡單；固定化酶及載體可多次重復利用，固定化酶生產(chǎn)成本低。因此該技術在工業(yè)上具有廣泛的應用前景。高分子微球具有一定的化學和機械穩(wěn)定性，能抵抗微生物和酸堿的作用，是優(yōu)良的固定化酶載體材料.針對制備高活性、高穩(wěn)定性固定化酶對載體材料的性能要求，評述了高分子微球的組成和功能性基團的可設計性、粒徑與形態(tài)可控性、多孔和大比表面積等結構性質(zhì)，概括了載體結構性質(zhì)對固定化酶催化活性的影響規(guī)律,提出了對不同性質(zhì)的生物酶"量體裁衣"，設計制備特效的載體材料是高分子微球固定化酶研究的發(fā)展趨勢.同時介紹了固定化青霉素?；负凸潭ɑ久冈诠I(yè)催化領域的應用.首先用分相法和填充法制作了兩種多孔玻璃微珠FXB5口TCBL用它們作為載體分別用物理吸附法、共價偶聯(lián)法和重氮法固定了a-淀粉酶，在對它們的固定效果比較后，選取了共價偶聯(lián)法進行了較詳細