實驗一紙層析法分離氨基酸

1、氨基酸的分離鑒定氨基酸的分離鑒定紙層析法紙層析法指導老師：鄭永良一、實驗目的一、實驗目的l掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學會分析待掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學會分析待 測樣品的氨基酸成分。測樣品的氨基酸成分。 二、實驗原理二、實驗原理l紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。當有機相流經固定相時，物質在兩相溶劑為流動相。當有機相流經固定相時，物質在兩相間不斷分配而得到分離。間不斷分配而得到分離。 l溶質在濾紙上的移動速度用溶質在濾紙上

2、的移動速度用RfRf值表示：值表示： lRfRf= =原點到層析斑點中心的距離原點到層析斑點中心的距離/ /原點到溶劑前沿的距原點到溶劑前沿的距離離 l在一定的條件下某種物質的在一定的條件下某種物質的RfRf值是常數。值是常數。RfRf值的大小值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質量和與物質的結構、性質、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。酸。 三、實驗器材三、實驗器材l（1 1）大燒杯（）大燒杯（5000mL5000mL）：）：1 1只只/ /組組 l（2 2）毛細管。）毛細管。 l（3 3）噴

3、霧器：公用。）噴霧器：公用。 l（4 4）培養(yǎng)皿：）培養(yǎng)皿：1 1只只/ /組。組。 l（5 5）層析濾紙（長）層析濾紙（長22cm22cm、寬、寬14cm14cm的的新華一號濾紙）：新華一號濾紙）：1 1張張/ /組。組。 l（6 6）直尺、鉛筆：自備。）直尺、鉛筆：自備。 l（7 7）電吹風：）電吹風：1 1只只/ /組。組。 l（8 8）托盤、針、白線：）托盤、針、白線：1 1套套/ /組。組。 l（9 9）手套：）手套：1 1雙雙/ /組。組。 l（1010）塑料薄膜：公用。）塑料薄膜：公用。 l（1111）小燒杯：）小燒杯：50mL50mL，1 1只只/ /組。組。 四、實驗試劑四、

4、實驗試劑l（1 1）擴展劑：將）擴展劑：將4 4體積正丁醇和體積正丁醇和1 1體積冰醋酸體積冰醋酸放入分液漏斗中，與放入分液漏斗中，與5 5體積水混合，充分振蕩，體積水混合，充分振蕩，靜置后分層，棄去下層水層。靜置后分層，棄去下層水層。 l（2 2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%0.5%的已知氨基酸溶液的已知氨基酸溶液3 3種種（亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸，脯氨（亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸，脯氨酸氨酸），酸氨酸），0.5%0.5%的待測氨基酸液的待測氨基酸液1 1種。種。 l（3 3）顯色劑：）顯色劑：0.1%0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。水合茚三酮正丁醇溶液。 實驗試劑實驗試

5、劑 五、實驗操作五、實驗操作l檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于檢查培養(yǎng)皿是否干燥、潔凈；若否，將其洗凈并置于干燥箱內干燥箱內120120烘干。烘干。 l（1 1）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約20mL20mL展層展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯中，用塑料薄膜密封起來，平衡薄膜密封起來，平衡20min20min。（2）規(guī)劃：帶上手套，取寬約）規(guī)劃：帶上手套，取寬約14cm、高約、高約22cm的層析濾的層

6、析濾紙一張。在紙的下端距邊緣紙一張。在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平處輕輕用鉛筆劃一條平行于底邊的直線行于底邊的直線A，在直線上，在直線上做做4個記號，記號之間間隔個記號，記號之間間隔2cm，這就是原點的位置。，這就是原點的位置。另在距左邊緣另在距左邊緣1cm處畫一條處畫一條平行于左邊緣的直線平行于左邊緣的直線B，在，在B線上以線上以A、B兩線的交點為原兩線的交點為原點標明刻度（以厘米為單點標明刻度（以厘米為單位），參見左圖。位），參見左圖。 （3 3）點樣：用毛細管浸液取樣，點在這四個位置上。同）點樣：用毛細管浸液取樣，點在這四個位置上。同一位置上需點一位置上需點2 23 3次，每

7、點完一點，立刻用電吹風熱風次，每點完一點，立刻用電吹風熱風吹干后再點，以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過吹干后再點，以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm3mm。每人須點。每人須點4 4個樣，其中個樣，其中3 3個是已知樣，個是已知樣，1 1個是待測樣個是待測樣品。品。 （4 4）層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側）層析：用針、線將濾紙縫成筒狀，紙的兩側 邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖3-33-3。向培養(yǎng)。向培養(yǎng)皿中加入擴展劑，使其液面高度達到皿中加入擴展劑，使其液面高度達到1cm1cm左右，左右，將點好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端將點好樣的

8、濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面在在下，擴展劑的液面在A A線下約線下約1cm1cm），罩上大燒），罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當上升到杯，仍用塑料薄膜密封。當上升到121215cm15cm，取，取出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，出濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，迅速用電吹風熱風吹干。迅速用電吹風熱風吹干。l（5 5）顯色：用噴霧器在）顯色：用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴通風廚中向濾紙上均勻噴上上0.1%0.1%茚三酮正丁醇溶液，茚三酮正丁醇溶液，然后立即用熱風吹干，即然后立即用熱風吹干，即可顯出各層析斑點，參見可顯出各層析斑點，參見左圖。左圖。l（6 6）計算各種氨基酸的）計算各種氨基酸的RfRf值，并判斷混合樣品中都有哪值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上，見些氨基酸，各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上，見表表3-23-2。 l（7 7）實驗完畢，倒掉用過的展層液和平衡液，將培養(yǎng)皿）實驗完畢，倒掉用過的展層液和平衡液，將培養(yǎng)皿洗凈，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的洗凈，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺，請老師驗收，實驗報告當場交給老師。操作臺，請老師驗收，實驗報告當場交給老師。l計算計算 RfRf= = 原點到層析斑點中心的距離原點到層析斑點中心的距離