流式細胞術(shù)蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗中心

1、流式細胞術(shù)一種在液流系統(tǒng)中，快速測定單個細胞或細胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細胞分開，以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細胞群體。目前最高分選速度已達到每秒鐘3萬個細胞。 現(xiàn)代流式細胞術(shù)綜合了流體力學(xué)技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)，是多學(xué)科多領(lǐng)域技術(shù)進步的結(jié)晶。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，為了滿足生命科學(xué)對細胞分析更高層次的要求，流式細胞技術(shù)

2、仍然在快速發(fā)展，并已經(jīng)在檢測技術(shù)、分選技術(shù)及高通量分析等方面取得了許多突破。流式細胞術(shù) - 簡史1934年A.莫爾達萬首次報道了使懸浮的紅細胞通過放置在顯微鏡載物臺上的玻璃毛細管的細胞自動計數(shù)方法。1956年W.H.庫爾特介紹一種利用細胞在導(dǎo)電溶液中,通過兩個小室間小孔（75100微米）時的電阻變化（稱為庫爾特電阻）進行細胞計數(shù)和測定細胞體積的裝置。1965年L.A.卡門茨基制成了多參數(shù)流式細胞計，可測定細胞大小和核酸含量。同年，M.J.富爾懷勒又制成細胞分選器。1969年范迪拉等應(yīng)用氬離子激光器和分層殼流技術(shù)，建立了一臺液流、照明光軸和檢測器軸互相正交的流式細胞計。以后，經(jīng)H.R.休利特等改

3、進了的細胞分選計，能使流動液體內(nèi)的細胞噴射到空氣中進行測量。但上述各系統(tǒng)中，所使用的激光光束以及設(shè)在收集熒光的檢測方向上的限制光欄都比液流中的細胞大，因而不能提供關(guān)于細胞形態(tài)學(xué)方面的信息，故稱為零分辨率系統(tǒng)。隨后，L.L.惠利斯和S.F.帕滕發(fā)展了一種低分辨率的狹縫掃描技術(shù)，可以測定細胞核熒光、細胞和細胞核的大小。1969年，W.格德和W.迪特里希描述了使用汞燈做光源的流式細胞光度計，在落射光照明下，可激發(fā)在流動室中與光軸平行流動的細胞。 流式細胞術(shù) - 原理流式細胞術(shù)待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進樣管而進入流動室，排成單列的

4、細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。細胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關(guān)（圖1）。 整個儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號和光散射信號。測定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示。 對細胞進行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動室發(fā)生振動，把噴嘴噴出的細胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴

5、含有細胞。這些細胞在形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測定了它們的信號（代表細胞的性質(zhì)），如果測得信號與所選定的要進行分選的細胞性質(zhì)符合，或者說，如果發(fā)現(xiàn)了要進行分選的細胞時則在這個選定細胞剛形成液滴時，儀器給整個液流充以短暫的正或負電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中被選定細胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細胞液滴則不帶電。帶有正電或負電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達到了分類收集細胞的目的。 流式細胞術(shù) - 應(yīng)用細胞生物學(xué)研究 流式細胞術(shù)可用于測定細胞周期各時相細胞的百分比。通過測定細胞群體中每個細胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。例如，在測定Hela細胞DNA含量分布

6、曲線上，第一個峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/靜止期）細胞,其次一個峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期有絲分裂期)細胞，從2C4C間的區(qū)域為S期（DNA合成期）細胞。采用繪圖法或計算機擬合法可計算出細胞周期各時相細胞占整個細胞群體的百分數(shù)。 用流式細胞術(shù)可進行多參數(shù)分析，即同時測定一個細胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。例如細胞經(jīng)吖啶橙染色后，DNA發(fā)綠色熒光，RNA發(fā)紅色熒光。測定這兩種熒光就能同時得知一個細胞內(nèi)的DNA和RNA含量。測定結(jié)果可用二維散點圖或三維立體圖表示。用這種方法可根據(jù)DNA和RNA含量而鑒別出G0與G1、M期和 G2期細胞

7、。用流式細胞術(shù)與液體閃爍技術(shù)相配合,還可求得細胞通過G1、S和G2+M期的時間(T、Ts、T+M及其變異系數(shù)。近年利用抗溴脫氧尿苷(Brdurd)單克隆抗體能發(fā)現(xiàn)滲入到細胞 DNA內(nèi)的溴脫氧尿苷。將此種熒光抗體技術(shù)與測定細胞 DNA含量相結(jié)合，是研究DNA合成和細胞周期的一種非常有用的技術(shù)。此外,流式細胞術(shù)還可測定細胞群體同步化的程度和所處的時期，鑒別死細胞和活細胞，利用熒光標(biāo)記配體，還可定量測定細胞表面和內(nèi)部的受體等。 遺傳學(xué)研究 用流式細胞術(shù)測定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖（圖2），稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式

8、染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。 免疫學(xué)研究 結(jié)合免疫熒光方法，流式細胞術(shù)可辨認和計數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細胞，例如用熒光素標(biāo)記的免疫球蛋白鑒別T和B淋巴細胞（圖3），根據(jù)細胞表面抗原的不同,進一步分辨出不同的T和B淋巴細胞亞群，以及測定每個細胞所帶抗原的數(shù)量、密度及其動力學(xué)參數(shù)等。也可用流式細胞分選技術(shù)將帶有“”和不帶有“”的某種特異抗原的細胞群體分類收集，供研究其功能特性。 流式細胞術(shù)對于判斷免疫缺陷癥，如愛滋病（獲得性免疫缺損綜合征）的重要特征，即T4和T8淋

9、巴細胞比例改變（T4細胞大量減少）以及判斷自身免疫病和確定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式細胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細胞上的熒光素標(biāo)記的外源凝集素，測定細胞表面積和熒光素結(jié)合位點的相對密度，結(jié)合細胞動力學(xué)測定每個細胞結(jié)合位點的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細胞表面結(jié)合的競爭性等。 腫瘤學(xué)研究 腫瘤細胞一般都含有異常數(shù)量的 DNA。在大多數(shù)實體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細胞，由于流式細胞術(shù)樣品制備方法簡單，測定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān)DNA倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測量 DNA含量的同時，再測定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細胞大小、核質(zhì)比等）則可進一步提高診斷的