熒光衍生試劑在高效液相色譜和電泳中的應(yīng)用

1、1熒光衍生試劑在高效液相色譜和電泳中的應(yīng)用熒光衍生試劑在高效液相色譜和電泳中的應(yīng)用導(dǎo)導(dǎo) 師：張玉奎師：張玉奎 學(xué)學(xué) 生：張生：張 琳琳2 引言引言 常用熒光衍生化試劑應(yīng)用簡(jiǎn)介常用熒光衍生化試劑應(yīng)用簡(jiǎn)介 展望展望 3 衍生的目的衍生的目的 衍生發(fā)應(yīng)方式衍生發(fā)應(yīng)方式 熒光衍生試劑的構(gòu)成熒光衍生試劑的構(gòu)成4 在線在線 (on line) 離線離線 (off line) 從衍生反應(yīng)的場(chǎng)所來(lái)分從衍生反應(yīng)的場(chǎng)所來(lái)分 柱前衍生化柱前衍生化 (pre-column derivatization) 柱上衍生化柱上衍生化 (on-column derivatization) 柱后衍生化柱后衍生化 (post-co

2、lumn derivatization) 從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來(lái)分從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來(lái)分 從是否形成共價(jià)鍵來(lái)從是否形成共價(jià)鍵來(lái)分分 標(biāo)記標(biāo)記 非標(biāo)記非標(biāo)記 5取代基熒光團(tuán)（試劑分子母體）反應(yīng)基團(tuán)膽磺酰肼 DNS-H6 芳香鄰二醛類(lèi) OPA 異硫氰酸酯類(lèi) FITC 酰氯類(lèi) FMOC 活性鹵類(lèi) NBD-Cl N-羥基琥珀酰亞胺活性酯類(lèi) AQC 7鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并惡二唑苯并惡二唑 NBD-Cl熒光素異硫氰酸酯熒光素異硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯AQC8 J Chro

3、matorgr. 1990,499:5579高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào) 2004, 25: 18919010J Chromatorgr. 1990,499:55711Anal. Biochem 2003,313 172712圖3 CEOC 衍生胺類(lèi)化合物色譜分離圖（23種）圖2 FMOC 衍生胺類(lèi)化合物色譜分離圖（23種）13 羰基氯類(lèi)： FMOC CEOC 磺酰氯類(lèi): DNs-Cl 鹵代三嗪類(lèi): EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）14分析化學(xué)分析化學(xué) 2003, 31, 6265151.苯酚 2.對(duì)氯苯酚 3. 2,5-二甲基苯酚 4. 2,4-二氯苯酚 5. 1,

4、4對(duì)苯二酚16 肼類(lèi)肼類(lèi) DNs-H CEOC-HDNs-H CEOC-H 氨基類(lèi)氨基類(lèi) 氨基甲基芘氨基甲基芘 17181.乳糖 2.甘露糖 3.葡萄糖 4.鼠李糖 5. 山梨糖(FL detection)咔唑咔唑-9-9-乙氧基羰基肼乙氧基羰基肼(CEOC-H)(CEOC-H)柱前衍生中性糖高效液相色譜分離柱前衍生中性糖高效液相色譜分離19IV IV 羧酸類(lèi)化合物的衍生試劑羧酸類(lèi)化合物的衍生試劑 溴甲基類(lèi) BrMMC 哌嗪基類(lèi) DBD-Pz 重氮甲烷基類(lèi) ADAM 其它類(lèi) 9-(2-羥乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽

5、重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)20熒光衍生試劑與羧酸的反應(yīng)熒光衍生試劑與羧酸的反應(yīng)214-4-氨甲基氨甲基-6,7-6,7-二甲基香豆素二甲基香豆素 (ADMC) (ADMC) 衍生羧酸衍生羧酸 色譜分離圖色譜分離圖Anal.Sci.1996,12:18922Fig.1 膽汁酸分離色譜圖（熒光檢測(cè)）. 衍生物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 ex=404, em=440nm9-(2-9-(2-羥乙基羥乙基)-)-吖啶酮吖啶酮 HEA HEA 衍生膽汁酸衍生膽汁酸 色譜分離圖色譜分離圖23V V 分離對(duì)映體的手性熒光衍生試劑分離對(duì)映體的手性熒光衍生試劑24Toshimasa Toy

6、ooka JapanJ.C.A 1998 822 215224 手性熒光衍生試劑手性熒光衍生試劑 R(-)DBD-PyNCS R(-)DBD-PyNCS 衍生分離衍生分離DLDL氨基酸氨基酸25OPA OPA 與手性硫醇與手性硫醇 衍生分離衍生分離DLDL氨基酸氨基酸N-異丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC)J.C.A 1999 832 12326目前目前常用常用衍生蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記試劑有：衍生蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記試劑有： 鄰鄰苯二甲醛苯二甲醛 (OPA) (OPA) 4- 4-氟氟-7-7-硝基苯并惡二唑硝基苯并惡二唑 (NBD-F)(NBD-F) 熒光素異硫氰酸酯熒光素異硫氰酸酯

7、 (FITC)(FITC) 3- 3-呋喃甲酰喹啉呋喃甲酰喹啉-2-2-羰醛羰醛 (FQ)(FQ)27 Fig.5 OPA 柱后標(biāo)記馬心肌紅蛋白質(zhì)毛細(xì)管電泳圖J.Am.Chem.Soc. 1995,117:332528 J.Am.Chem.Soc. 1989,111: 500829DNA序列分析中所用的四種熒光衍生試劑Nature 1986,327: 674Nature 1986,327: 6743031分析化學(xué)中的有機(jī)試劑在分析化學(xué)中占有與分析儀器同等重分析化學(xué)中的有機(jī)試劑在分析化學(xué)中占有與分析儀器同等重要的地位，熒光衍生化試劑則是有機(jī)分析試劑的一類(lèi)重要分要的地位，熒光衍生化試劑則是有機(jī)分析試劑的一類(lèi)重要分支。支。 性能優(yōu)良的熒光衍生化試劑可能性能優(yōu)良的熒光衍生化試劑可能將將成為成為某些某些物質(zhì)的高靈敏物質(zhì)的高靈敏高選擇性分析的關(guān)鍵高選擇性分析的關(guān)鍵，熒光衍生試劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用熒光衍生試劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用也也正正朝這朝這個(gè)個(gè)方向發(fā)展。方向發(fā)展。在實(shí)際工作中將可能遇到各種現(xiàn)有熒光衍生試劑