分子標(biāo)記技術(shù)課件課件

1、關(guān)于分子標(biāo)記技術(shù)課件現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共16頁分子標(biāo)記的概念分子標(biāo)記的概念 n廣義的分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。n蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。n狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納： 能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片片 段，它直接反映基因組段，它直接反映基因組DNA間的差異。間的差異。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共16頁分子標(biāo)記的特點(diǎn)分子標(biāo)

2、記的特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共16頁分子標(biāo)記的類型分子標(biāo)記的類型基于雜交的分子標(biāo)記基于雜交的分子標(biāo)記，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性長度片段多態(tài)性）?；?DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（Single n

3、ucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共16頁基于基于 PCR的分子標(biāo)記的分子標(biāo)記，它又分為兩類： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA） 微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）,又稱SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter s

4、imple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site)位點(diǎn)特異的位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)標(biāo)記方法記方法多位點(diǎn)標(biāo)記方法多位點(diǎn)標(biāo)記方法基于基于PCR技術(shù)的技術(shù)的DNA擴(kuò)增方法擴(kuò)增方法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共16頁 AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增 CAPS（Cleaved amplified polymor

5、phic sequence） CAPS是先擴(kuò)增，再酶切擴(kuò)增片段PCR與酶切相結(jié)合的方法與酶切相結(jié)合的方法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共16頁微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA Microsatellite，MS/Simple Sequence Repeat,SSR 短的，簡單的串聯(lián)重復(fù)序列； 基元是1-6個堿基(有的定義為1-5個堿基)； 廣泛存在于真核細(xì)胞整個基因組的不同位置上； 高度多態(tài)性(微衛(wèi)星DNA長度的多態(tài)性) ； 微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列； 共顯性標(biāo)記。特點(diǎn)特點(diǎn)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共16頁ISSR原理簡介原理簡介nISSR(inter-simple sequence repeat)是Zie

6、tkeiwitcz等于1994年在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記。其基本原理是:用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3端或5端加上2-4個隨機(jī)核昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的兩個SSR區(qū)域之間的多個條帶通過聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。由于微衛(wèi)星在基因組中廣泛分布，且等位變異特別豐富，因而可以檢測到高的多態(tài)性。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共16頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共16頁ISSR分子標(biāo)記的特點(diǎn)分子標(biāo)記的特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：ISSR 標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和SSR 的優(yōu)點(diǎn),

7、所需DNA模板的量少、多態(tài)性豐富, 無需試劑盒、結(jié)果記錄方便、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡單、穩(wěn)定性較高、呈孟德爾式遺傳 n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：是PCR 擴(kuò)增時最適反應(yīng)條件需要一定時間摸索, 其標(biāo)記大多為顯性標(biāo)記, 在解決交配系統(tǒng)、計算雜合度和父系分析等問題時效果不佳 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共16頁特性特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布 普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在遺傳共顯性多數(shù)顯性共顯性多數(shù)顯性多數(shù)顯性多態(tài)性中高高高非常高等位檢測是不是是不是不是檢測位點(diǎn)數(shù)1311015050更多20100樣品信息量低中高高高非常高基因組區(qū)域底拷貝編碼整個基因組整個基因組整個基因組整個基因組技術(shù)難度中等簡

8、單簡單簡單中等重復(fù)性高中等高高高DNA樣品量230g1100ng50-100ng250ng100ng耗費(fèi)時間慢快快快中等可靠性高中等高高高現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共16頁ISSR實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程DNA提取及檢測提取及檢測 引物設(shè)計引物設(shè)計PCR擴(kuò)增擴(kuò)增電泳檢測電泳檢測結(jié)果統(tǒng)計及分析結(jié)果統(tǒng)計及分析必須對擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括對Tag酶、引物濃度及其退火溫度、M g 2+濃度、模板濃度等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共16頁 引物設(shè)計是 ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵、最重要的一步。基因組中SSR 一般為 26個寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常為 5或 3端加錨定的二核苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)

9、一般為48 次，使引物的總長度達(dá)到 1618bp 。 5或 3端用于錨定的堿基數(shù)目一般為 14個，錨定的目的是引起特定位點(diǎn)退火， 使引物與相匹配 SSR的一端而不是中間結(jié)合，從而對基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增、檢測。由于植物基因組中SSR最多的 是 (AT) n、(TA) n、(GA) n 、(CT) n等二核苷酸重復(fù)序列 ，在選擇 ISSR引物時，應(yīng)以二核苷酸重復(fù)序列為主，少選寡聚三核苷酸、四核苷酸引物。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共16頁 PCR 產(chǎn)物需經(jīng)電泳分離、染色顯示后才能進(jìn)行譜帶觀察、統(tǒng)計。瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前通用的兩種電泳技術(shù)。一般采用1.5%-2%的瓊脂糖凝膠電泳或5%-8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者EB 染色紫外光下觀察、拍照；后者經(jīng)銀染可見光下觀察記錄，拍照。一般當(dāng)瓊脂糖電泳分離效果不理想時采