TAIL-PCR-原理基礎知識

1、TAIL-PCR-原理基礎知識TAIL-PCR定義定義：熱不對稱交錯 PCR( Thermal Asymmetric Interlaced PCR,簡稱 TAIL-PCR) 是一種用來分離與已知序列鄰近的未知 DNA 序列的分子生物學技術 ?；驹砘驹恚豪媚繕诵蛄信缘囊阎蛄性O計3個嵌套的特異性引物(special primer ,簡稱sp1 ,sp2 ,sp3 ) ,用它們分別和1個具有低Tm值的短的隨機簡并引物(Arbitrary degenerate prime 簡稱AD)相組合,以基因組DNA作為模板, 通過3輪具熱不對稱的溫度循環(huán)的分級反應來進行PCR擴增，從而獲得已知序列旁

2、的側翼序列。由一個特異性引物和一個簡并引物相組合構成的 PCR反應叫做“半特異性 PCR”。這種反應會產生 3 種不同類型的產物 : ( 1) 由特異性引物和簡并引物擴增出的產物 ; ( 2) 由同一特異性引物擴增出的產物; ( 3) 由同一簡并引物擴增出的產物。在 TAIL-PCR反應中, 后兩種非目標產物可以通過以嵌套的特異性引物進行的后續(xù)反應來消除 。known seq Unknown seqSP1SP2SP3AD第1輪特異性產物第3輪特異性產物第2輪特異性產物第一輪模板為基因組DNA，引物SP1+AD第二輪模板將第一輪產物稀釋約500-1000倍作為模板，引物SP2+AD第三輪模板將第

3、二輪產物稀釋約500-1000倍作為模板，引物SP3+ADTAIL-PCRTAIL-PCR操作流程：操作流程：1 1、基因、基因組組DNADNA的獲?。旱墨@?。嚎捎?CTAB/SDS提取真菌或植物基因組DNA，用溶菌酶法提取細菌基因組DNA 。以基因組DNA作為第一輪PCR反應的模板。2、已知序列的驗證：已知序列的驗證：在進行 PCR 實驗之前必須對已知序列進行驗證，以確認已知序列的正確性。具體方法為：根據(jù)已知序設計特異性引物（擴增長度最好不少于 500 bp ），對模板進行 PCR 擴增，然后對 PCR 產物進行測序， 再與參考序列比較確認已知序列的正確性。3.引物的設計：引物的設計：TAI

4、L-PCR 反應對引物的要求較高，3 個嵌套的特異性引物長度一般在2030 bp 之間，Tm 值一般設5868。SP1、 SP2 和 SP3 之間最好相距100 bp以上以便在電泳時更容易區(qū)分 3輪PCR產物.隨機引物是按照物種普遍存在的蛋白質的保守氨基酸序列設計的，相對較短，長度一般是 14 bp左右， Tm值介于3048之間。4 4. .三輪三輪PCRPCR反應反應：第第一輪一輪PCR反應由 5 次高特異性反應、 1 次低特異性反應、 10 次較低特異性反應和 12 次熱不對稱的超級循環(huán)構成。通過 5 次高特異性的反應 ,使 sp1 與已知的序列(載體或 T-DNA 等)退火并延伸 ,目標

5、序列擴增成直線性型上升；1 次低特異性的反應使簡并引物結合到較多的目標序列上 ,接下來 10 次較低特異性的反應使兩種引物均能與模板退火 ,從而使原來由高嚴謹性循環(huán)所產生的單鏈靶DNA復制成雙鏈DNA.最后是進行12次熱不對稱的TAIL循環(huán)(超級循環(huán)即高特異性和低特異性循環(huán)交替)，目的片段得以指數(shù)性地擴增。經(jīng)過第一輪反應得到了不同濃度的 3 種類型的產物 : 特異性產物( 型)和非特異性產物(型和型) 。 第一輪第一輪PCR反應反應第第二輪二輪反應則將第一輪反應的產物稀釋1000倍作為模板, 通過 10 次熱不對稱的超級循環(huán),使特異性的產物被選擇性地擴增, 而非特異性的產物被壓制到極低的含量

6、。第二輪第二輪PCR反應反應第第三輪三輪反應又將第二輪反應的產物稀釋1000倍作為模板 ,一般設置為普通的 PCR 反應或熱不對稱的超級循環(huán)。通過上述3輪PCR反應可獲得與已知序列鄰近的目標序列。第三輪第三輪PCR反應反應5.5.電泳檢測電泳檢測。取第一，第二，第三輪PCR產物各3ul,用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。6.6.測序驗證測序驗證。切膠回收清晰的電泳條帶，以SP3為引物對PCR產物進行測序驗證。操作注意事項：操作注意事項：1.引物設計：特異引物長度為22-26nt,GC含量為45%-55%，Tm 一般為 5868 。再按照物種普遍存在的蛋白質的保守氨基酸序列設計一系列簡并引物 ,簡并

7、引物相對較短 ,長度為 14 bp , Tm 為 3048 。 特異引物與隨機引物Tm值要求至少相差10度以上。特異性引物和簡并引物的選擇直接影響擴增的效果。如果不能獲得滿意的擴增結果 ,則應該在預備實驗中重新設計特異性引物或者換用其它的簡并引物。2.TAIL PCR 的引物濃度：為減少錯配，特異引物應保持較低濃度；而 簡并引物的濃度要高，一般為 pmol/L，以滿足引物的結合效率。3.反應條件：在 TAIL-PCR 反應中，高特異性循環(huán)的退火溫度設為 65 左右，較低特異性循環(huán)的退火溫度設為44，低特異性循環(huán)的退火溫度設為 25 -3O 。在高嚴緊的循環(huán)中，退火溫度要盡可能高，比特異引物的T

8、m要高 1-5 ?？筛鶕?jù)需要選擇延伸時間，延伸時間長可以獲取較長的 DNA 片段，但是容易產生非特異性 PCR 擴增。一般延伸時間為 2 min 。TAIL-PCRTAIL-PCR技術有以下優(yōu)點技術有以下優(yōu)點 : ( 1) 簡單。只要設計好引物, 即可以用基因組 DNA 作模板直接篩選到目標序列 。節(jié)省了 PCR反應前后的許多費時、費力的操作程序。只需幾納克的 DNA 即可作為模板 ,對其純度的要求也不很高。( 2) 特異性高。用短的簡并引物和長的特異性嵌套引物相組合,通過不對稱的溫度循環(huán)和分級反應 ,使反應體系有利于特異引物的擴增,最終的擴增產物中目的片段占絕對優(yōu)勢 ,反應產物可以直接用做探針標記和測序模板。( 3) 高效靈敏。使用任何一個 AD 引物, 在60% 80 % 的反應中能夠產生特異性產物。運用不同的 AD 引物就能夠有效地擴增到目標片段 。( 4)快速。整個 TAIL-PCR 反應循環(huán)能夠在 1 d內完成 ,可以快速地獲得目標片段。( 5) 不涉及連接反應,反應產物準確可靠, 重復性好 。TAILTAIL