miRNA常用試驗(yàn)方法

1、miRNA 常用實(shí)驗(yàn)方法一、miRNA 的檢測(cè)方法miRNA 的 realtime-PCR 檢測(cè)方法1、realtime-PCR 引物設(shè)計(jì)miRNArealtime-PCR 引物設(shè)計(jì)方法：1）stem-loopRT 引物設(shè)計(jì)：基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6 個(gè)堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序歹 U 為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC例如設(shè)計(jì) miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU物，只需在通用莖環(huán)序列后架上 miRNA3末端的 6 個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列，即GTCGTATCCAGTGCAGG

2、GTCCGAGGTATTCGCACTGGACATGAC2）realtime 上游引物設(shè)計(jì)：miRNA 序列除去 3端 6 個(gè)堿基的剩余部分作為上游引物，如miR-1 的上游引物為（注意把 U 改為 T）:TGGAATGTAAAGAAW 弓 I 物的 Tm 值（一般參考DNAMAN 如果 Tm 值較低，則在 5端加 GC 使 Tm 值接近 60 度。因此 miR-1 的上游引物可設(shè)計(jì)為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT4 度。3）下游引物是通用的，序列為 GTGCAGGGTCCGAGGT4）引物設(shè)計(jì)好后，需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)引物的特異性。一般需要做溶解曲線(xiàn)來(lái)檢測(cè)引物的特異性；同時(shí)最好將 P

3、CR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)產(chǎn)物是否單一（因產(chǎn)物長(zhǎng)度很小，需要 3 犯上的瓊脂糖膠）。2、miRN 蚊轉(zhuǎn)錄miRNA 的反轉(zhuǎn)錄與一般基因的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程基本相同。因?yàn)槠洚a(chǎn)物很短，用最普通的逆轉(zhuǎn)錄酶即可。我們一般使用的是 TIANGEN 的 MLV 逆轉(zhuǎn)錄體系為：RNA500ng2ug5xbuffer2uldNTP0.25ulDDT0.25ulRRI0.25ulMLV0.25ulRTprimer0.5ulH2O（RNasefree）補(bǔ)至 10ul程序?yàn)椋≒CR 儀中通常命名為 CTFRT16 度，30min；42 度，60min;85 度，5min；4 度，hold。!做 miRNA 的反轉(zhuǎn)錄時(shí)，注意不要

4、忘記內(nèi)參的 RT,即一個(gè)樣品至少要做目的 miRN 所口內(nèi)參兩管反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。3、realtime-PCR 實(shí)驗(yàn)miRNA 逆轉(zhuǎn)錄完成后得到的 cDNA 即可進(jìn)行下一步 PCR 在確認(rèn)引物的特異性后，我們可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。一般每個(gè)樣品至少需要 3 個(gè)平行孔。 RealtimePC 林系為（ABI 定量 PCF!Kijk4irLtLpI?PKI.Usac-lKfiiii.icVector(48l8bp)Wl121KprtISacIMiuwneISmaIXho則則I用用方方dill5111521283236534、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析常見(jiàn)的啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄因子）活性分析實(shí)驗(yàn)：1）連續(xù)截短確定核心啟動(dòng)子?？寺』虻纳嫌握{(diào)控序列，做連續(xù)的截短，如構(gòu)建-2000-1500,-1500-1000,-1000-500,-5000,0500 一系列克隆，轉(zhuǎn)入細(xì)胞，觀察熒光素酶活性，以此判斷哪一段序列對(duì)于該基因的轉(zhuǎn)錄活性起關(guān)鍵作用。例如:-2000-1500 和-1500-1000 有很高的活性，而-1000-500 活性很弱，則可判斷核心啟動(dòng)子區(qū)在-1500-1000。2）特定轉(zhuǎn)錄因子對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的分析。我們構(gòu)建包含該轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列（上游調(diào)控序列）的報(bào)告基因質(zhì)粒，與轉(zhuǎn)錄因子