淺議馬鈴薯有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析及病毒檢測技術(shù)

1、淺議馬鈴薯有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析及病毒檢測技術(shù)論文導(dǎo)讀：上世紀(jì)40年代以來建立的電子顯微鏡技術(shù)，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和提高，己經(jīng)成為了病毒檢測和鑒定的重要方法。研究表明Dot-EuSA比DAs-ELISA靈敏度高，而且經(jīng)濟(jì)快捷、直觀、成本低，適合種薯生產(chǎn)中大量樣品的馬鈴薯病毒的定性檢測。 關(guān)鍵詞：馬鈴薯，有害生物，風(fēng)險(xiǎn)分析，病毒檢測1.生物學(xué)試驗(yàn)方法 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法也叫指示植物法，其原理是:檢測病毒在其鑒別寄主上產(chǎn)生穩(wěn)定并具有特征性的癥狀或在其指示植物上快速出現(xiàn)感染癥狀，從而可以用來檢測出某種病毒或檢測出某種病毒的存在。在植物病毒的檢測上，指示植物法有其他方法所不能替代的地位。 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)明顯，

2、其操作簡單易行，成本低廉，通過摩擦或媒介昆蟲等方法進(jìn)行接種，所需毒源材料很少。但這種方法周期較長，前期準(zhǔn)備工作量較大。指示植物在不同的環(huán)境條件下，表現(xiàn)出的受感染的癥狀有差異;幾種病毒復(fù)合侵染時(shí)可能引起另-種癥狀，另外個(gè)別癥狀反應(yīng)難以重復(fù)，鑒別不同的病毒時(shí)所需的指示植物也有不同。 2.電子顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡技術(shù)是通過觀察病毒顆粒形態(tài)、大小、結(jié)果、內(nèi)含體組成形狀和亞結(jié)構(gòu)等方面的特征來確定病毒的存在和種類。上世紀(jì)40年代以來建立的電子顯微鏡技術(shù)，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和提高，己經(jīng)成為了病毒檢測和鑒定的重要方法。目前較為重要的有負(fù)染色技術(shù)、超薄切片技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、放射自顯影技術(shù)等。 通常情況下植物病毒

3、侵染寄主細(xì)胞后，常常引起-系列的細(xì)胞病理變化，如引起線粒體聚集、膜結(jié)構(gòu)退化、出現(xiàn)大量液泡細(xì)胞壁增厚、胞間連絲結(jié)構(gòu)的改變等現(xiàn)象。通過電鏡技術(shù)就可以直觀、快速、簡單的既觀察到病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)，又可以發(fā)現(xiàn)病毒侵染寄主后引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 電鏡操作需要-定技能，工作量集中但不易太大。電鏡技術(shù)的檢測靈敏度與ELISA反應(yīng)相似，但不如核酸雜交技術(shù)。同時(shí)，依據(jù)病毒粒體的大小，形態(tài)、彎曲程度等特征的判斷只能到科或?qū)伲^難定性為某種病毒。電鏡的觀察只能作為一個(gè)初步判斷。此外，并不是每一種病毒侵染植物都會(huì)形成內(nèi)含體等特殊結(jié)構(gòu)。這些問題的存在都或多或少的制約了電鏡技術(shù)的廣泛應(yīng)用。論文參考網(wǎng)。 3.免疫學(xué)方法 在現(xiàn)

4、今的植物病毒檢測中，使用最廣泛的免疫學(xué)方法是酶聯(lián)免疫吸附測定。該方法是上世紀(jì)70年代在熒光抗體和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫測定技術(shù)，是一種相對(duì)吸附和免疫酶技術(shù)相結(jié)合的方法，將抗原和抗體包被在固相支持物上，使免疫反應(yīng)在固體表面進(jìn)行，并借助結(jié)合在抗體或抗原上酶與底物的反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色來進(jìn)行檢測。它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、適合于測定大量樣品、對(duì)人體基本無害等諸多的優(yōu)點(diǎn)。而且克服了常規(guī)血清學(xué)方法受病毒濃度、粒體形態(tài)和抗血清用量等因素的限制。但是ELISA方法檢測病毒也有它的局限性。有時(shí)血清學(xué)上相關(guān)的病毒卻在核酸序列上并不完全同源，甚至沒有同源性，從而會(huì)使ELISA鑒定反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)假陽

5、性的現(xiàn)象。ELISA首先是用于人和動(dòng)物的傳染病檢查，目前ELISA主要有雙抗體夾心法(DAS-ELISA)，硝酸纖維素膜法(NCM-ELISA)和快速ELISA三種方法。 3.1雙抗體夾心法 這種方法是以聚苯乙烯塑料管或凝血滴定板為支持物，采用直接ELISA，基本步驟是先加入第-抗體，再-次加入病毒提取液、第二抗體、底物，所以叫做雙抗體夾心。 3.2硝酸纖維素膜法 硝酸纖維素膜法(NCM-ELISA)又稱Dot-ELISA，該方法是以NCM為固相載體，通常采用間接ELISA，基本步驟是先將待測樣品點(diǎn)在NCM膜上，然后依次加入抗病毒抗體、酶標(biāo)第二抗體、底物。此法與常規(guī)法相比有很多優(yōu)點(diǎn)，NCM對(duì)蛋

6、白質(zhì)有較高的親和力，提供蛋白質(zhì)較大的結(jié)合表明，使檢測的靈敏度提高，而且反應(yīng)產(chǎn)生鮮艷的色斑，形成強(qiáng)烈對(duì)比。NCM法測定所需的最低病毒量低于常規(guī)的ELISA的1000倍。研究表明Dot-EuSA比DAs-ELISA靈敏度高，而且經(jīng)濟(jì)快捷、直觀、成本低，適合種薯生產(chǎn)中大量樣品的馬鈴薯病毒的定性檢測。 3.3快速酶聯(lián)免疫吸附法 常規(guī)ELISA中各步反應(yīng)是在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行的，快速ELISA中各步反應(yīng)是在37下恒溫振搖狀態(tài)下進(jìn)行的，抗體、抗原、酶標(biāo)孵育時(shí)間相對(duì)縮短，此方法可比常規(guī)方法快3.5h。 4.分子生物學(xué)檢測方法 分子生物學(xué)檢測是通過病毒的核酸來檢測病毒，它比血清學(xué)方法的靈敏度要高，特異性強(qiáng)、檢測迅

7、速、操作簡潔。目前應(yīng)用較廣的分子生物學(xué)技術(shù)包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)、雙鏈技術(shù)、基因芯片技術(shù)等。論文參考網(wǎng)。 4.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是Mullis等人發(fā)明的-種體外快速擴(kuò)增特定基因或序列的方法，經(jīng)過變性-退火-延伸這一循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，DNA擴(kuò)增的數(shù)量呈指數(shù)增長。對(duì)于多數(shù)RNA病毒來說，則需要先將RNA基因在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)的DNA然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這稱為RT-PeR。論文參考網(wǎng)。 RT-PCR技術(shù)與免疫學(xué)方法相比不需要制備抗體，檢測所需的毒源量也僅僅是其的1/1000倍，具有更加靈敏、快速、特異性更強(qiáng)等優(yōu)勢。近年來成為病毒檢測和分子生

8、物學(xué)科領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的技術(shù)。非特異性擴(kuò)增是PCR反應(yīng)原理上的缺陷，實(shí)驗(yàn)中可能受到引物、模板等被污染的影響而出現(xiàn)假陽性。因此PCR方法并不是萬能或-定準(zhǔn)確的檢測方式。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)衍生出了更為多樣化更符合檢測需要的技術(shù)，包括以下凡種: (l)多重RT-PCR 此PCR反應(yīng)體系中使用多對(duì)病毒特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增多種病毒各自不同的特定基因片段，且擴(kuò)增片段間大小各不相同，再通過凝膠電泳檢測電泳帶的多少和大小即可辨別病毒的種類，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒的同時(shí)檢測。PRusso等、Singh等利用這種方法同時(shí)檢測了馬鈴薯卷葉病毒和馬鈴薯Y病毒。 (2)熒光競爭-RT-PCR CF-R

9、T-PCR技術(shù)中使用的各種病毒特異性引物分別采用不同的熒光染料標(biāo)記，不同病毒的PCR產(chǎn)物釋放的熒光顏色不同，根據(jù)熒光顏色來判斷樣品中病毒的種類和大小。 (3)免疫捕獲 IC-RT-PCR檢測技術(shù)是免疫學(xué)技術(shù)和RT-PCR技術(shù)相結(jié)合建立起來的檢測技術(shù)。該技術(shù)不需要進(jìn)行病毒RNA的抽提，操作更容易，并且在不破壞病毒粒體的情況下，既可實(shí)現(xiàn)病毒的檢測。這種方法為不具備病毒特異性抗體或采用免疫學(xué)技術(shù)很難檢測的病毒提供了一個(gè)可行的方法。 4.2 PCR反應(yīng)的影響因素 PCR反應(yīng)體系五要素分別是引物、酶、dNTP、模板和Mg2+;反應(yīng)條件包括:變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。理論上講，有助于PC

10、R反應(yīng)的措施都有助于檢測靈敏度的提高，如:增加Mg2+的濃度，增加TaqDNA酶的量，增加反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等。但這些因素的增加并不一定能產(chǎn)生理想的效果。Mg2+的濃度和TaqDNA酶的量過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則產(chǎn)物生成量又不足，不利于電泳觀察;PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)-般選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。另外，退火溫度的選擇是一個(gè)很重要的參數(shù)，合理的退火溫度在能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物的同時(shí)可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合。 另外，PCR反應(yīng)中因?yàn)闃O其微量的污染就可能造成假陽性的產(chǎn)生，所以應(yīng)避免標(biāo)本間的交叉污染、PCR試劑等的污染問題。 4.3 核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù) 核

11、酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)是根據(jù)互補(bǔ)的核酸單鏈可以相互結(jié)合的原理，將-段核酸單鏈以某種方式加以標(biāo)記，制成探針，與互補(bǔ)的待測病毒核酸雜交，帶有病毒原探針的雜交核酸能指示病原的存在。NASH包括以下步驟:樣品制備和膜的制備;樣品固定和預(yù)雜交;洗去剩余探針;放射自顯影。研究表明NASH檢測技術(shù)比ELISA法更靈敏可靠，適合大量樣品檢測，對(duì)病毒和類病毒的侵染診斷更佳，但其靈敏度和特異性不如RT-PeR。 4.4雙鏈RNA技術(shù) 研究發(fā)現(xiàn)含有RNA的植物病毒在復(fù)制時(shí)會(huì)產(chǎn)生RNA的復(fù)制中間型，即雙鏈RNA。雙鏈RNA在寄主體內(nèi)存在穩(wěn)定，可以利用-些物理、化學(xué)的方法分離出來，獲得純化的dsRNA。每一種RN.A病毒、類病

12、毒在寄主內(nèi)有特異的dsRNA，其遷移率、分子量、片段數(shù)均不同，而在健康植物組織中無大分子的dsRNA，故dsRNA經(jīng)提純、電泳、染色后，在凝膠上所顯示的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類。此方法已用于-些病毒組，如馬鈴薯Y病毒組、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組的分類研究。 4.5基因芯片技術(shù) 基因芯片是采用高速打印和光刻合成技術(shù)在硅玻璃或尼龍膜上制造陣列，樣品DNA/RNA通過PCR擴(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)滲入熒光標(biāo)記分子，與微陣列雜交后通過熒光掃描儀掃描，及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量基因順序及表達(dá)的信息?；蛐酒梢苑譃閮纱箢?，-時(shí)原位合成，其適合于寡核昔酸;二是直接點(diǎn)樣，多用于大片段DNA?；蛐酒夹g(shù)目前還是很多不足，例