生物化學(xué)酶劉博整理

1、第五章 酶第一節(jié) 導(dǎo) 言一、 酶的概念（一）酶是生物催化劑酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有催化生物反應(yīng)功能的蛋白質(zhì)大分子及核酸。 酶生物催化劑：蛋白質(zhì)類(lèi)： Enzyme (天然酶、生物工程酶) 克隆酶、遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新 核酸類(lèi)：Ribozyme ; Deoxyribozyme 模擬生物催化劑酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)(Enzymatic reaction)。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物(substrate)。胞外酶與胞內(nèi)酶 酶雖是由細(xì)胞產(chǎn)生的,但并非必須在細(xì)胞內(nèi)才能起作用,有些酶被分泌到細(xì)胞外才發(fā)生作用。這類(lèi)酶稱“胞外酶”。大部分酶在細(xì)胞內(nèi)起催化作用稱為“胞內(nèi)酶”。（二）酶的化

2、學(xué)本質(zhì)1酶是蛋白質(zhì)1926年Sumner第一次從刀豆種子中提取了脲酶結(jié)晶，證明其具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。30年代，Northrop又分離出結(jié)晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，證明酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。酶的相對(duì)分子質(zhì)量大；酶具有蛋白質(zhì)的特性如：兩性解離、膠體性質(zhì)、加熱使酶變性、顏色反應(yīng)等；酶可以被蛋白酶水解而喪失活性；許多酶的氨基酸順序已被測(cè)定；969年人工合成了牛胰核糖核酸酶。2. Ribozyme的化學(xué)本質(zhì)是RNA在已鑒定過(guò)的數(shù)千種酶中，絕大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。但在1982年，美國(guó)科學(xué)家T.Cech發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)的26SrRNA前體具有自我拼接的催化活性。T.Cech將這種RNA命名為

3、“Ribozyme”。核酶（ Ribozyme ）：指對(duì)RNA具有催化活性的RNA 。二、酶的催化特性（一）與無(wú)機(jī)催化劑相比，有如下共同點(diǎn)：反應(yīng)前后都不發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量變化；能加快反應(yīng)速度,但不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)；都能降低反應(yīng)所需的活化能；需要量小。（二）酶的作用特點(diǎn)極高的催化效率，高度的專一性，易失活（蛋白質(zhì)變性），活性可調(diào)控（激活、抑制），常需輔助因子（輔酶、輔基等）1.極高的催化效率反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高1081020，與加普通催化劑相比可提高1071013。脲酶的催化效率比Fe粉高1015倍。反應(yīng)式如2H2O2 -2H2O + O2 以轉(zhuǎn)換數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)比較其效率 用鐵離子， 6

4、x 10 -4 mol/mol.s 轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number） ：每個(gè)酶分子每分鐘催 血紅素， 6 x 10 -1 mol/mol.s 化底物的分子數(shù)。 H2O2 酶， 3 6 x 10 6 mol/mol.s 碳酸酐酶 96000萬(wàn)2.高度的專一性一種酶只能作用于某一類(lèi)或某種特定的物質(zhì)，這種性質(zhì)稱為酶的專一性。（1） 結(jié)構(gòu)專一性 概念：酶對(duì)所催化的分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇。 類(lèi)別：絕對(duì)專一性和相對(duì)專一性（2） 立體異構(gòu)專一性 概念：酶除了對(duì)底物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求外，對(duì)其立體異構(gòu)也有一定的要求 類(lèi)別：旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性絕對(duì)專一性：有些酶只作用于一種底物，催化一個(gè)

5、反應(yīng)， 而不作用于任何其它物質(zhì)。 如：過(guò)氧化氫酶底物：過(guò)氧化氫。琥珀酸脫氫酶底物：琥珀相對(duì)專一性：這類(lèi)酶對(duì)結(jié)構(gòu)相近的一類(lèi)底物都有作用。包括鍵專一性和基團(tuán)專一性。鍵專一性：只要求作用于一定的化學(xué)鍵，而對(duì)鍵兩端的基團(tuán)無(wú)嚴(yán)格的要求。酯酶（酯鍵） 二肽酶（肽鍵）13消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性14旋光異構(gòu)專一性：當(dāng)?shù)孜锞哂行猱悩?gòu)體時(shí)一種酶只能作用于其中的一種。如：L-AA氧化酶只能催化L-AA氧化，而對(duì)D-AA無(wú)作用。 順?lè)串悩?gòu)專一性：對(duì)具有順式和反式異構(gòu)的底物具嚴(yán)格的選擇性。；例15三、 酶的組成（一）酶的組成單純酶 (simple enzyme)結(jié)合酶 (conjugated enzyme)：全酶

6、 holoenzyme ：蛋白質(zhì)部分（酶蛋白 apozyme）全酶=酶蛋白+輔助因子 非蛋白部分：小分子有機(jī)化合物 (輔助因子cofactor) 金屬離子輔因子：輔酶、輔基、金屬離子 輔酶：與酶蛋白結(jié)合疏松，可以用透析法除去。 輔基：與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析法除去。輔基和輔酶多為維生素參與形成的小分子有機(jī)物。金屬離子：與酶蛋白結(jié)合。結(jié)合酶(全酶)的特點(diǎn): 只有全酶才有催化活性。一種酶蛋白只結(jié)合一種輔助因子，而一種輔助因子可結(jié)合多種酶蛋白。酶蛋白決定反應(yīng)專一性，高效催化作用；輔助因子決定反應(yīng)的種類(lèi)和性質(zhì)。（二）酶的結(jié)構(gòu)1.酶的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相同，是具有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)酶蛋白

7、的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，酶可分為：1)單體酶: 只有一條多肽鏈,分子量在13,000-35,000之間，一般是水解酶, 如蛋白酶、羧肽酶。2)寡聚酶：由兩個(gè)或兩個(gè)以上的亞基組成,亞基之間由非共價(jià)鍵相連，亞基可以是相同的,也可以不同，分子量在35,000-幾百萬(wàn)，如丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶。3)多酶體系：由幾個(gè)酶有組織的聚集在一起,功能上相互配合，第一個(gè)酶的產(chǎn)物是第二個(gè)酶的底物，如丙酮酸脫氫酶、脂肪酸合成酶。（三） 酶的命名習(xí)慣命名：來(lái)源 + 底物 + 酶(字) 例 胃蛋白酶 底物 + 反應(yīng)性質(zhì) + 酶(字) 例 乳酸脫氫酶系統(tǒng)命名：所有底物反應(yīng)性質(zhì) 如：琥珀酸：FAD氧化還原酶 例21第二節(jié) 酶的分類(lèi)酶的分

8、類(lèi) 國(guó)際E學(xué)委員會(huì)制定的“國(guó)際系統(tǒng)分類(lèi)法”將酶促反應(yīng)分為六大類(lèi):1.氧化還原酶：催化氧化還原反應(yīng)的酶。例 乳酸脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)232.轉(zhuǎn)移酶：催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)：243.水解酶：:催化催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反應(yīng)：254.裂合酶：催化從底物上移去某些基團(tuán)而形成雙鍵的非水解性反應(yīng)及其逆反應(yīng)的酶。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。265.異構(gòu)酶：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程

9、的酶。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。276.合成酶：又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類(lèi)反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 如：Gln合成酶, 丙酮酸羧化酶。 A + B + ATP AB + ADP + Pi第三節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）必需基團(tuán)（essential group）概念: 酶蛋白中一些與酶的活性密切相關(guān)的基團(tuán)，稱酶的必需基團(tuán)。常見(jiàn)的必需基團(tuán)：His 的咪唑基、Ser/Thr 的羥基、Cys 的巰基、Glu 的羧基等。(二) 酶原與酶原的激活1.概念：（1）酶原（zymogen） ：有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成

10、或初分泌時(shí)，或在其發(fā)揮催化功能前只是酶的無(wú)活性前體，稱為酶原。（2）酶原的激活：在一定條件下，酶原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為有活性的酶的過(guò)程。實(shí)質(zhì)：酶原被修飾后，形成了正確的分子構(gòu)象和活性中心，由此可見(jiàn)酶分子的特定結(jié)構(gòu)和酶的活性中心的形成是酶分子具有催化活性的基本保證。2.酶原激活的機(jī)理酶原在特定條件下一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解掉一個(gè)或幾個(gè)短肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心34 35酶原激活的生理意義避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。有的酶原可以視為酶的儲(chǔ)存形式。在需要時(shí)，酶原適時(shí)地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。二、酶的

11、活性與其高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系（一）酶的活性中心(active center )概念：在酶分子中由必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，形成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，該區(qū)域能與底物特異性結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，稱為活性中心或 活性部位?；钚灾行模航Y(jié)合部位（與底物結(jié)合，決定酶的專一性） 催化部位（底物的敏感鍵在此處斷裂而形成新鍵，決定酶的高效性及反應(yīng)性質(zhì)）溶菌酶的活性中心：谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基團(tuán)；色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是結(jié)合基團(tuán)；色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是結(jié)合基團(tuán)；（二）核糖核酸酶1.變性：構(gòu)象被破壞，活性中心被破壞，失去生物學(xué)活性。2.催化：具有天然構(gòu)象

12、的核糖核酸酶在底物的誘導(dǎo)下，構(gòu)象發(fā)生一定改變，形成了正確的活性中心，使酶發(fā)揮了催化作用。（三）聚合與解聚（四）同工酶(isoenzyme)能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但在蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。例 乳酸脫氫酶（LDH）43研究意義：作為遺傳的標(biāo)志；作為臨床診斷指標(biāo)；研究某些代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種等。，不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜44第四節(jié) 酶的作用機(jī)理一、酶促反應(yīng)的本質(zhì)（一）酶的催化作用與分子活化能 化學(xué)反應(yīng)自由能方程式G =H -TS（G是總自由能的變化， H 是總熱能的變化，S是熵的變化）當(dāng)G0，反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行。當(dāng)G0，反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行?；罨?/p>

13、：分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指在一定溫度下，1mol 反應(yīng)物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需的自由能。加快反應(yīng)速度的方法：供給能量，如加溫、光照等降低活化能酶和一般催化劑的作用就是降低化學(xué)反應(yīng)所需的活化能，從而使活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快。（二）酶與反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個(gè)低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。Pauling提出過(guò)渡態(tài)理論認(rèn)為：E與S的過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)，親和力最強(qiáng)，釋放的結(jié)合能使反應(yīng)活化能降低，有利于S 跨越能壘，使反應(yīng)加速。 證明：人工合成了過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物；用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物制備

14、出抗體酶。50中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō) E+S可逆ESEP中間產(chǎn)物存在的證據(jù)：1同位素32P標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合）；2吸收光譜法（過(guò)氧化物酶與過(guò)氧化氫結(jié)合） ；3電鏡直接觀察。吸收光譜的變化可證明：H2O2酶（含鐵卟啉）：紅褐色，在645、583、498nm處有光吸收； H2O2 -E加H2O2后：酶液由褐轉(zhuǎn)紅，增加了561、530nm光吸收帶，說(shuō)明有新物質(zhì)；H2O2 + E 若加入氫供體（焦性沒(méi)食子酸）后：二條新帶消失。H2O2 -E + AH2 A +E+ 2H2O二、酶反應(yīng)機(jī)制（一）誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（Koshland，1958）：酶活性中心的結(jié)構(gòu)有一定的靈活性，當(dāng)?shù)孜锱c酶分子結(jié)合時(shí)，受底物分

15、子的誘導(dǎo), 酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生了有利于與底物結(jié)合的變化，使反應(yīng)所需的催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)正確地排列和定向，轉(zhuǎn)入有效的作用位置，這樣才能使酶與底物完全吻合，結(jié)合成中間產(chǎn)物。（酶專一性的“誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)”）“鎖鑰學(xué)說(shuō)”（Fischer，1890）：酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)互相吻合，緊密結(jié)合成中間絡(luò)合物。（二）使酶具有高催化效率的因素酶分子為酶的催化提供各種功能基團(tuán)和形成特定的活性中心，酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，使分子間的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。1. 鄰近定向效應(yīng)酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物過(guò)程中，底物分子從稀溶液中密集到活性中心區(qū)，并使活性中心的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間正確定向排列所產(chǎn)生的效應(yīng)。

16、使分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)的過(guò)程。2. “張力”與“形變”酶與底物的結(jié)合，不僅酶分子發(fā)生構(gòu)象變化，同樣底物分子也會(huì)發(fā)生扭曲變形，使底物分子的某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應(yīng)活化能。3. 酸堿催化通過(guò)向反應(yīng)物（作為堿）提供質(zhì)子或從反應(yīng)物（作為酸）奪取質(zhì)子來(lái)達(dá)到加速反應(yīng)的一類(lèi)催化。（廣義酸堿催化，Bronsted的酸堿定義）蛋白質(zhì)中起酸或堿催化的功能基團(tuán)有氨基、羧基、咪唑基、巰基和酚基。影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩種因素：（1）酸或堿的強(qiáng)度（pK）；（2）質(zhì)子傳遞的速度。His的咪唑基最活躍。組氨酸的咪唑基：（1） pK值約為6.7-7.1，在接近中性的條件下，一半以廣義酸的形式存在，另一半以

17、廣義堿的形式存在，因而它既能作為質(zhì)子供體，又能作為質(zhì)子受體，有效地進(jìn)行酸堿催化。（2）咪唑基供出和接受質(zhì)子的速度很快，其半衰期短，小于0.1毫微秒。所以許多酶活性中心都有組氨酸殘基。 酶分子中可作為酸鹼催化的功能基團(tuán)614.共價(jià)催化催化劑通過(guò)與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。 5.酶活性中心是低介電區(qū)域可排除高極性的水分子，使S的敏感鍵與E的 催化基團(tuán)有高反應(yīng)力，從而加速反應(yīng)

18、。第五節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一、酶促反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的概念：研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素，并加以定量的闡述。其中酶與底物之間的作用問(wèn)題是研究酶促反應(yīng)的核心問(wèn)題。影響因素：包括：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定（一）底物濃度的影響 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響65用中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)解釋底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系曲線的二相現(xiàn)象：E+S可逆ESEP當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，有多余的酶沒(méi)與底物結(jié)合，隨著底物濃度的增加，中間絡(luò)合物的濃度不斷增高。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，溶液中的酶全部與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，雖增加底物濃度也不會(huì)有更多的中間產(chǎn)物生成。（二）米氏方程-定

19、量表達(dá)底物濃度與酶反應(yīng)速率的關(guān)系1913 年Michaelis 和Menten 提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡(jiǎn)稱米氏方程。米氏方程式： K1 K3中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō):E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P K2 VmaxS米氏方程（Michaelis-Menten equation）V= ¾¾¾¾ Km + S 米氏方程解釋底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響規(guī)律米氏方程式推導(dǎo)過(guò)程:穩(wěn)態(tài)：是指 ES 的生成速度與分解速度相等，即 ES 恒定 K1 ( EES) SK2 ES + K3 E

20、S v= K3 ES （1）整理得：（EES）S K2+K3 令:¾¾¾¾ = ¾¾¾¾ = Km (米氏常數(shù)) （2）ES K1則(2)變?yōu)? （EES）S Km ES整理得: ES K3ESES（3）將(3) 代入 (1) 得 V （4）Km+S Km+S當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時(shí)，即EES,反應(yīng)達(dá)最大速度VmaxK3ESK3E (5)將(5)代入(4)得米氏方程式: VmaxS 71V1. Km 的求法 Km+S(1)雙倒數(shù)作圖法(又稱林-貝氏作圖）VmaxS KmV 兩邊同取倒數(shù) 1/V=1/

21、S +1/VmaxKm +S Vmax (2) Hanes 作圖法：在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘 S 72（3）Eddie-Hofstee作圖法（v 法）v Km+ vS = Vmax ·S v S = Vmax S - v Km v = vmax Km 74（4）Eisenthal和Cornish-Bowden法 (Direct linear plot ) 75 2. 米氏常數(shù)的意義及測(cè)定v = Vmax/ 2，則： km= S意義：（1） km是酶的一個(gè)基本的特征常數(shù)。其大小與酶的濃度無(wú)關(guān)，而與具體的底物有關(guān)，且隨著溫度、pH和離子強(qiáng)度而改變。 （2）從km可判斷酶的專一性和天然

22、底物。 Km最小的底物，通常就是該酶的最適底物，也就是天然底物。 （3）當(dāng)k2k3時(shí)， km的大小可以表示酶與底物的親和性。 K1 K3E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P km= （k2 +k3)/k1 Km k2 / k1 SE K2 km可以看作ES的解離常數(shù)ks ：km= ks = 當(dāng)km大時(shí)，說(shuō)明ES容易解離，酶與底物結(jié)合的親和力小。 ES（4）從km的大小，可以知道正確測(cè)定酶活力時(shí)所需的底物濃度。實(shí)際用途：可由所要求的V求S；例：求反應(yīng)速度達(dá)最大反應(yīng)速度90%時(shí)的底物濃度。從米氏方程中求得：當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的90

23、%，則 Vmax · S 90%V =100%VS/(km +S) 即 S = 9km v = （5）km還可以推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝途徑。 km + S+乳酸脫氫酶（1.7×10-5）®¾¾乳酸 丙酮酸+丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）®¾¾乙酰CoA +丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）®¾¾乙醛當(dāng)丙酮酸濃度較低時(shí)，代謝走哪條途徑?jīng)Q定于km最小的酶。米氏常數(shù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖法直接求得：先測(cè)定不同底物濃度的反應(yīng)初速度，從v與S的關(guān)系曲線求得Vmax ，然后

24、再?gòu)?/2 Vmax求得相應(yīng)的S即為km（近似值）。注意： 米氏方程只是反映了底物單分子時(shí)酶反應(yīng)速度與底物濃度之間的定量關(guān)系，但這個(gè)方程不適用包括一種以上的底物和其他物質(zhì)的影響的酶反應(yīng)。但可以根據(jù)這個(gè)方程推出各種復(fù)雜酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程。二 . 酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 83當(dāng) S >> E 時(shí)，Vmax = k3 E 1）特征：成正比 2）條件：底物濃度足夠大三、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響 841 . 特征：雙重影響 3.特點(diǎn)：低溫不變性，不是酶的特征性常數(shù)2 .最適溫度 4. 應(yīng)用：低溫麻醉、低溫保存酶制品酶的最適溫度: 酶活性最高時(shí)的溫度, 也即酶的催化效率最高, 酶促反應(yīng)速度最大時(shí)

25、的溫度。四、pH 對(duì)反應(yīng)速度的影響 851. 特征：極端pH引起變性 3 .特點(diǎn)：不同酶不同pH不是酶的特征性常數(shù)2. 最適pH（optimum pH） 4.應(yīng)用：在最適pH時(shí)進(jìn)行酶促反應(yīng)或測(cè)酶活性酶的最適pH : 酶催化活性最高時(shí)的pH。在一定的pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定的pH對(duì)酶作用的影響機(jī)制：過(guò)酸過(guò)鹼導(dǎo)致酶蛋白變性, 影響底物分子解離狀態(tài), 影響酶分子解離狀態(tài),影響酶的活性中心構(gòu)象五、激活劑對(duì)酶作用的影響凡能提高酶活力的物質(zhì)都是酶的激活劑。如Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。類(lèi)別 金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 陰離子： Cl-、Br

26、- 有機(jī)分子:還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：EDTA六、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響抑制劑（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為抑制劑。區(qū)別于酶的變性: 1) 抑制劑對(duì)酶有一定選擇性 (2) 引起變性的因素對(duì)酶沒(méi)有選擇性抑制作用的種類(lèi): 不可逆性抑制作用 可逆性抑制作用: 競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的必需基團(tuán)的性質(zhì)受到某種化學(xué)物質(zhì)的作用而發(fā)生改變，使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心或重要的必需基團(tuán)以非共價(jià)或共價(jià)的

27、方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。（一）不可逆性抑制作用概念：抑制劑以共價(jià)鍵與酶的活性中心上的 必需基團(tuán)結(jié)合，使酶失活，且不能用透析、超濾等方法去除，這種抑制作用稱為不可逆性抑制作用。類(lèi)型：羥基酶的抑制 (1) 抑制劑：有機(jī)磷農(nóng)藥（敵敵畏、敵百蟲(chóng)、1059等） (2) 舉例（酶）：膽堿酯酶（choline esterase）（3）解救：解磷定、阿托品（pyridine aldoxime methyliodide, PAM）羥基酶: 絲氨酸側(cè)鏈上的羥基為必需基團(tuán)的酶 92 （二）可逆性抑制作用(reversible inhibition)概念：抑制劑以非共價(jià)鍵與酶可逆性結(jié)合，使酶活性降低或消失，

28、用透析、超濾等方法可去除，使酶恢復(fù)活性，這種抑制作用稱為可逆性抑制作用。類(lèi)型: 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制1.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（competitive inhibition）（1） 概念：抑制劑與酶的底物結(jié)構(gòu)相似，可與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，阻礙酶與底物形成中間產(chǎn)物，從而抑制酶的活性的現(xiàn)象。（2)反應(yīng)模式: K1 (EI ®¾¬ I +）E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P （3）* 特點(diǎn) 抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似 兩者都與酶的活性中心結(jié)合 抑制程度取決于抑制劑與酶的相對(duì)親和力和與底物濃度的相對(duì)比例

29、增加底物濃度可減低或解除抑制作用 動(dòng)力學(xué)變化：Vmax不變、Km 值變大(4）競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)方程: 競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征曲線：97VmaxS 1 Km I 1 1 V = - = (1+ ) + Km(1+I/Ki)+S V Vmax Ki S VmaxVSv = kin=1+I /ki)+S 98km(1+I /ki)+S加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km 變大，酶促反應(yīng)速度減小。Vmax不變。(5) * 舉例 丙二酸抑制琥珀酸脫氫酶 99 磺胺類(lèi)藥物抑制細(xì)菌二氫葉酸合成酶 100對(duì)氨基苯甲酸 二氫葉酸合成酶 二氫葉酸還原酶 二氫蝶呤 ®¾¾®¾

30、90; FH2 ®¾¾®¾¾ FH4 谷氨酸 磺胺藥 (-) 氨甲蝶呤(-)2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（non-competitive inhibition）(1) * 概念：有些抑制劑可與酶的活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，不影響酶與底物的結(jié)合，酶與底物的結(jié)合也不影響酶與抑制劑的結(jié)合，但酶-底物-抑制劑復(fù)合物（ESI）不能生成產(chǎn)物，這種抑制作用稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 K1(2)反應(yīng)模式: (EI ®¾¬ I +）E+S ®¾¬ ES ®¾¾ E+P +S &#

31、174;¾¬ ESI ®¾¬®¾¬ I+(3)特點(diǎn)： K1抑制劑與底物結(jié)構(gòu)不相似 抑制劑與酶在活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合 抑制結(jié)果取決于抑制劑的濃度 增加底物濃度不能解除抑制作用 動(dòng)力學(xué)變化：Vmax 變小、Km 值不變（4）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)方程: 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征曲線：1 Km I 1 1 I - = (1+ ) + ( 1+ ) 104V Vmax Ki S Vmax Ki如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg）通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；EDTA結(jié)合金屬

32、離子引起的抑制作用也屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，這類(lèi)抑制作用不會(huì)因提高底物濃度而減弱。3. 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（uncompetitive inhibition）（1) * 概念：抑制劑僅與酶-底物復(fù)合物（ES）結(jié)合，使中間產(chǎn)物ES的量下降，從而既減少了產(chǎn)物的生成，又減少了從中間產(chǎn)物解離出游離酶和底物的量，稱為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 (2)反應(yīng)模式: K1 E+S ®¾¬ (ESI ®¾¬ I +）ES ®¾¾ E+P (3) * 特點(diǎn)： 抑制劑只與 ES 復(fù)合物結(jié)合 抑制結(jié)果取決于

33、抑制劑的濃度 增加底物濃度不能解除抑制作用 動(dòng)力學(xué)變化：Vmax 變小、Km 值變小各種可逆性抑制作用的比較 作用特征 無(wú)抑制劑 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制與結(jié)合的組分 E E,ES ES動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km Km 增大 不變 減小最大速度 Vmax 不變 降低 降低林-貝氏作圖斜率 Km/ Vmax 增大 增大 不變 縱軸截距 1/ Vmax 不變 增大 增大橫軸截距 -1/ Km 增大 不變 減小第六節(jié) 酶的多樣性和活性的調(diào)節(jié)一、核 酶80年代初期，美國(guó)Cech和Altman各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，從而改變了生物體內(nèi)所有的酶都是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。這個(gè)發(fā)現(xiàn)曾被認(rèn)為是近十多

34、年來(lái)生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一。為此Cech和Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。（一）核酶的催化性質(zhì)RNA作用于RNA核酶催化的反應(yīng)主要包括:水解反應(yīng)(RNA限制性內(nèi)切酶活性)，連接反應(yīng)(聚合酶活性)和轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng)等。后來(lái)，核酶的其他作用底物也已被發(fā)現(xiàn)，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。（二） 核酶的種類(lèi)按作用底物方式不同分為，自然界現(xiàn)有（1）催化分子內(nèi)反應(yīng)的核酶，自我剪接(selfsplicing)核酶（四膜蟲(chóng)rRNA，需鳥(niǎo)苷和Mg2+） 自我剪切(self-cleavage)核酶 (不需鳥(niǎo)苷)（2）催化分子間反應(yīng)(如原核生物RNaseP中的RNA)的核酶。（三）核酶的研究意義

35、及應(yīng)用前景 1.基因治療：根據(jù)錘頭結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)原理設(shè)計(jì)核酶基因，構(gòu)建于特定的表達(dá)載體，在不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)已經(jīng)成功。結(jié)果表明核酶基因?qū)爰?xì)胞或體內(nèi)可以阻斷基因表達(dá)，用作抗病毒感染，抗腫瘤的有效藥物，前景誘人，應(yīng)用將是廣泛的。2.分子進(jìn)化：具有催化功能RNA的重大發(fā)現(xiàn)，表明RNA是一種既能攜帶遺傳信息又有生物催化功能的生物分子。因此，很可能RNA的出現(xiàn)早于蛋白質(zhì)和DNA，是生命起源中首先出現(xiàn)的生物大分子，而一些有酶活性的內(nèi)含子可能是生物進(jìn)化過(guò)程中殘存的分子“化石”。 （四）核酶的研究中的兩個(gè)問(wèn)題1核酶催化效率太低。2由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶(RNase)所破壞。因此，要將核酶應(yīng)用于

36、體內(nèi)阻斷基因表達(dá)或作為抗病毒的臨床藥物，還要做大量的研究工作。二、調(diào)節(jié)酶(regulatory enzyme)通過(guò)改變自身活性來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性，通常是通過(guò)酶分子結(jié)構(gòu)的變化來(lái)改變其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速度。（一）共價(jià)修飾酶（covalent modification enzyme)酶蛋白多肽鏈上某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，在某種酶的催化作用下，發(fā)生了可逆的化學(xué)修飾，分子共價(jià)連接（或脫掉）一定的化學(xué)基團(tuán)，稱為共價(jià)修飾（covalent modification ），酶被修飾后，稱為共價(jià)修飾酶。共價(jià)修飾調(diào)節(jié)的類(lèi)型磷酸化與脫磷酸化（最常見(jiàn)） 乙?；c脫乙酰化甲基化與脫甲基化 腺苷化與脫腺苷化肌肉中磷酸化酶的磷酸化

37、和去磷酸化過(guò)程：118由激素啟動(dòng)磷酸化的級(jí)聯(lián)機(jī)制 （二）別構(gòu)酶（allosteric enzyme）概念：有些酶分子表面除了具有活性中心外，還存在被稱為調(diào)節(jié)位點(diǎn)（或別構(gòu)位點(diǎn)）的調(diào)節(jié)物特異結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)物結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上引起酶的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的活性提高或下降，這種現(xiàn)象稱為別（變）構(gòu)效應(yīng)（allosteric effect）,具有上述特點(diǎn)的酶稱別（變）構(gòu)酶（allosteric enzyme）。1.別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)部位1）活性部位：負(fù)責(zé)E對(duì)S的結(jié)合與催化；2）別構(gòu)部位：可結(jié)合調(diào)節(jié)物，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度 。這兩部位可在不同亞基或同一亞基不同部位上。2. 別構(gòu)效應(yīng)劑 (allosteric effe

38、ctor) 導(dǎo)致別構(gòu)效應(yīng)的代謝物別構(gòu)激活劑（allosteric activator）-使酶活性增加的效應(yīng)劑（底物）別構(gòu)抑制劑（allosteric inhibitor）-使酶活性降低的效應(yīng)劑（產(chǎn)物）別構(gòu)激活劑： 正協(xié)同，加快反應(yīng)速度（酶分子結(jié)合一分子底物或效應(yīng)物后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，這種新的構(gòu)象有利于后續(xù)分子與酶的結(jié)合，大大促進(jìn)后續(xù)分子與酶的親合性） ，多為S曲線，如：ATP對(duì)ATCase。別構(gòu)抑制劑： 負(fù)協(xié)同，減慢反應(yīng)速度，多為代謝終產(chǎn)物。如：CTP對(duì)ATCase。3.別構(gòu)酶的特點(diǎn)1)有多個(gè)亞基，即為四級(jí)結(jié)構(gòu)；2)酶分子中除了有結(jié)合底物并催化反應(yīng)的活性中心外，還有可以結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心。

39、活性中心和別構(gòu)中心可能位于不同的亞基或相同的亞基的不同部位。4. 別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)及別構(gòu)酶對(duì)酶反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)1)大多數(shù)別構(gòu)酶具有正協(xié)同效應(yīng)（酶分子結(jié)合一分子底物或效應(yīng)物后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，這種新的構(gòu)象有利于后續(xù)分子與酶的結(jié)合，大大促進(jìn)后續(xù)分子與酶的親合性），其初速度與底物濃度的關(guān)系呈S形的v-S曲線 124當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生很小的變化時(shí)，別構(gòu)酶就可極大地控制著反應(yīng)速度。在正協(xié)同效應(yīng)中使得酶反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化極為敏感。2）另一類(lèi)別構(gòu)酶具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)，其動(dòng)力學(xué)曲線在表現(xiàn)上與雙曲線相似，但意義不同具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶在底物濃度較低的范圍內(nèi)酶活力上升快，但再繼續(xù)下去，底物濃度雖有較大的提高，但反應(yīng)速度

40、升高卻較小。使酶反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化不敏感。125大多數(shù)別構(gòu)酶不符合米氏方程。1.非別構(gòu)酶曲線 2.正協(xié)同別構(gòu)酶 3.負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶126酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)示意圖127 別構(gòu)酶與別構(gòu)調(diào)節(jié)128 三、多功能寡聚酶有的寡聚酶所含的亞基結(jié)構(gòu)不同，每種亞基表現(xiàn)不同的功能，因而整個(gè)酶分子催化兩個(gè)或兩個(gè)以上的相關(guān)反應(yīng)，這種寡聚酶稱為多功能寡聚酶。大腸桿菌的色氨酸合成酶含A和B兩種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)A含有一個(gè)亞基，蛋白質(zhì)B含有兩個(gè)亞基。這兩種蛋白質(zhì)各自催化一個(gè)化學(xué)反應(yīng)。 大腸桿菌色氨酸合成酶催化的化學(xué)反應(yīng)吲哚甘油磷酸 ® 吲哚 3磷酸甘油醛吲哚 L-絲氨酸 ® L-色氨酸當(dāng)兩個(gè)A蛋白與一

41、個(gè)B蛋白結(jié)合形成、聚合體時(shí)，就構(gòu)成了完整的色氨酸合成酶（以表示）。它能將上述兩個(gè)反應(yīng)偶聯(lián)而催化總反應(yīng)：吲哚甘油磷酸L-絲氨酸 ® L-色氨酸3-磷酸甘油醛四、人工酶人工合成的具有催化活性的蛋白質(zhì)或多肽（一）抗 體 酶133 134過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物®¾¾免疫動(dòng)物®¾¾抗體此抗體具有：1）加快反應(yīng)速度：102 - 105倍； 2）具酶性質(zhì)：專一性、催化活性、酶動(dòng)力學(xué)行為均符合。抗體酶的研究?jī)r(jià)值 為酶的過(guò)渡態(tài)理論提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù) 2.廣闊的應(yīng)用前景（1）按照人們的設(shè)計(jì)對(duì)特定的肽鍵進(jìn)行水解的抗體酶，將為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提供新的手段。（2）

42、醫(yī)學(xué)。（3）制藥工業(yè) 。突變酶 用基因定位突變技術(shù)修飾天然酶基因，然后用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該突變基因的酶，被稱為突變酶。模擬酶b-benzyme 136催化側(cè)鏈連接到環(huán)糊精上，可模擬胰凝乳蛋白酶第七節(jié) 酶活力(enzyme activity)的測(cè)定一酶活力1.酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示，酶催化的反應(yīng)速率愈大，酶的活力愈高；反應(yīng)速率愈小，酶的活力就愈低。兩者呈線性關(guān)系。所以測(cè)定酶的活力就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速率。 139酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。

43、V = p / t p = v t引起酶促反應(yīng)速率降低的原因(1)底物濃度的降低； (2)產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；(3)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用 (4)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶蛋白部分失活等。因此測(cè)定酶活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，反應(yīng)初速率與酶量呈線性關(guān)系，因此可以用初速率來(lái)測(cè)定制劑中酶的含量。 2酶的活力單位(U，activity unit) 酶活力單位的定義：某種酶在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)酶作用的底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。有2種表示方法：IU （常用） Kat國(guó)際酶活力單位1961年,國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用統(tǒng)一的“國(guó)際單位”(IU)來(lái)表示酶活力。規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件(

44、溫度25)下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾(umo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,定為一個(gè)酶活力單位，即 1 IU = 1 umolmin。 1972年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)又推薦一種新的酶活力國(guó)際單位，即Katal(簡(jiǎn)稱Kat)單位。規(guī)定為：在最適條件下，每秒鐘能催化1摩爾(mo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為1Kat單位(1Kat=1mol·s1)。Kat單位與IU單位之間的換算關(guān)系如下：1 Kat = 60×106 IU 1IU = 160 Kat二酶的比活力(specific activity)比活力:每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)。比活力 = 活力Umg蛋白= 總活力U/總蛋白m

45、g有時(shí)用每g酶制劑或每m1酶制劑含有多少個(gè)活力單位來(lái)表示(Ug或Uml)。比活力大小的含義：可用來(lái)比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力愈大，表示酶的純度愈高。三酶活力的測(cè)定方法 測(cè)定酶活力就是測(cè)定產(chǎn)物增加量或底物減少量，主要根據(jù)產(chǎn)物或底物的物理或化學(xué)特性來(lái)決定具體酶促反應(yīng)的測(cè)定方法，最常用的方法介紹如下：(1) 分光光度法 (2) 熒光法 (3) 同位素測(cè)定方法 (4) 電化學(xué)法（1）分光光度法（spectrophotometry）：多利用產(chǎn)物在紫外或可見(jiàn)光部分的光吸收性質(zhì)，選擇適當(dāng)波長(zhǎng)，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程的進(jìn)行情況。簡(jiǎn)便、節(jié)約時(shí)間和樣品，可以檢測(cè)微量水平的變化。（2）熒光法(fluorometry)：主要利用底物或產(chǎn)物的熒光性質(zhì)。靈敏度高，但易受到干擾。（3）同位素測(cè)定法：同位素標(biāo)記底物，反應(yīng)后經(jīng)分離，檢測(cè)產(chǎn)物的脈沖數(shù)，即可換算成酶的活力單