酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISAELISA夾心法測(cè)定抗原ELISA間接法測(cè)定

1、會(huì)計(jì)學(xué)1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISAELISA夾心法測(cè)夾心法測(cè)定抗原定抗原ELISA間接法測(cè)定間接法測(cè)定原理及意義原理及意義 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)ELISA)是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的新型免疫檢對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的新型免疫檢測(cè)技術(shù)。測(cè)技術(shù)。 將已知抗原或抗體吸附在固相載體微

2、孔聚苯乙烯塑料板上，通將已知抗原或抗體吸附在固相載體微孔聚苯乙烯塑料板上，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測(cè)樣品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測(cè)樣品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)抗體（酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原免疫反應(yīng)的抗體（酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原免疫反應(yīng)的特異性，又不影響酶本身的活性）和底物后，在相應(yīng)酶底物的作特異性，又不影響酶本身的活性）和底物后，在相應(yīng)酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與標(biāo)記物中相應(yīng)的抗體或抗原的用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與標(biāo)記物中相應(yīng)的抗體或抗原的含量呈正比，由此可測(cè)定抗原或抗體的含量。含量呈正比，由此可測(cè)定抗原或抗體的含

3、量。 常用的常用的ELISAELISA法有法有雙抗體夾心法測(cè)定抗原和間接法測(cè)定抗體。雙抗體夾心法測(cè)定抗原和間接法測(cè)定抗體。ELISAELISA法雙抗體夾心法測(cè)定抗原法雙抗體夾心法測(cè)定抗原1.1.原理原理一步法一步法二步法二步法常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法一步法 將圖中的第將圖中的第2 2步和第步和第3 3步同時(shí)進(jìn)行，允許混合加入，其形步同時(shí)進(jìn)行，允許混合加入，其形成的免疫復(fù)合物，基本不影響目測(cè)的結(jié)果，適用于目測(cè)結(jié)果成的免疫復(fù)合物，基本不影響目測(cè)的結(jié)果，適用于目測(cè)結(jié)果。二步法二步法 如圖中第如圖中第2 2步和第步和第3 3步由

4、于分步進(jìn)行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主步由于分步進(jìn)行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主要用于需要定量檢測(cè)時(shí)。要用于需要定量檢測(cè)時(shí)。2.2.材料（以測(cè)材料（以測(cè)HBsAgHBsAg為例）為例）試劑：試劑：HBsAgHBsAg診斷試劑盒診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.3.方法方法加樣：每組加樣：每組7 7微孔，待檢微孔，待檢4 4孔，空白對(duì)照孔，空白對(duì)照1 1孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各1 1孔。分別加陰、陽(yáng)性對(duì)照孔。分別加陰、陽(yáng)性對(duì)照1 1滴和滴和50ul50ul待測(cè)樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置待測(cè)樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。加酶：除空白對(duì)

5、照孔外，每孔加加酶：除空白對(duì)照孔外，每孔加1 1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。洗滌：用洗滌液（按說(shuō)明配制）注滿各孔，靜置洗滌：用洗滌液（按說(shuō)明配制）注滿各孔，靜置2020秒，甩去洗秒，甩去洗滌液，重復(fù)滌液，重復(fù)4 4次，最后一次在吸水紙上拍干。次，最后一次在吸水紙上拍干。顯色：每孔加底物液顯色：每孔加底物液A A 、B B 各各1 1滴（滴（50ul50ul），輕拍混勻，置），輕拍混勻，置3737水浴水浴1515分鐘，肉眼觀察。分鐘，肉眼觀察。終止：每孔加終止液終止：每孔加終止液1 1滴（滴（50ul50ul），輕拍混勻。）

6、，輕拍混勻。4.4.結(jié)果測(cè)定結(jié)果測(cè)定 用酶標(biāo)儀（用酶標(biāo)儀（450nm450nm）測(cè)定各孔吸光度）測(cè)定各孔吸光度ODOD值（先用空白孔校零），值（先用空白孔校零），P/NP/N值值2.12.1者判為者判為HBsAgHBsAg陽(yáng)性，陽(yáng)性，2.12.1者判為陰性。者判為陰性。ELISAELISA法法間接法測(cè)定抗體間接法測(cè)定抗體1.1.原理原理2.2.材料（以測(cè)結(jié)核抗體為例）材料（以測(cè)結(jié)核抗體為例）試劑：結(jié)核抗體診斷試劑盒試劑：結(jié)核抗體診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.3.方法方法包被抗原：在聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中加抗原包被抗原：在聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中加抗

7、原100100ll，4 124 121818小時(shí)。小時(shí)。用用1 1BSABSA或正常兔血清或正常兔血清44、12121818小時(shí)阻斷，小時(shí)阻斷，44冰箱備用冰箱備用。洗滌：用前應(yīng)進(jìn)行漂洗去除雜蛋白，用洗滌液洗洗滌：用前應(yīng)進(jìn)行漂洗去除雜蛋白，用洗滌液洗3 3次，每次次，每次3 3分鐘。分鐘。加待測(cè)樣本：將血清稀釋成加待測(cè)樣本：將血清稀釋成1 1：5050，每份標(biāo)本加復(fù)孔，每孔，每份標(biāo)本加復(fù)孔，每孔100100ll，3737保溫保溫3030分鐘。設(shè)已知的陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照。分鐘。設(shè)已知的陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照。洗滌洗滌3 3次后，加兔抗次后，加兔抗IgGIgG酶結(jié)合物，酶結(jié)合物，3737保溫保溫303

8、0分鐘，以相同分鐘，以相同的方法洗滌的方法洗滌3 3次。次。加新鮮配制的鄰苯二胺底物溶液和雙氧水溶液各加新鮮配制的鄰苯二胺底物溶液和雙氧水溶液各100100ll。靜靜止止2020分分鐘鐘，再加入，再加入3mol/L3mol/L硫酸每孔硫酸每孔50l50l終終止反止反應(yīng)應(yīng)。4.4.結(jié)果測(cè)定結(jié)果測(cè)定肉眼觀察：白色背景上觀察四孔呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)，與已知陽(yáng)性肉眼觀察：白色背景上觀察四孔呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)，與已知陽(yáng)性和陰性孔比較。和陰性孔比較。酶聯(lián)儀比色：酶聯(lián)儀用酶聯(lián)儀比色：酶聯(lián)儀用492nm492nm測(cè)測(cè)ODOD值。正常人血清值。正常人血清ODOD0.390.39，結(jié)核患者結(jié)核患者0.40.4。正常人存在著

9、結(jié)核抗體，一般為。正常人存在著結(jié)核抗體，一般為0.20.20.390.39。兒童卡介苗接種和隱性結(jié)核菌感染時(shí)可兒童卡介苗接種和隱性結(jié)核菌感染時(shí)可0.40.4，但患結(jié)核病結(jié)核，但患結(jié)核病結(jié)核抗體抗體ODOD值值0.60.6，為輕度升高。，為輕度升高。常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法一步法 將圖中的第將圖中的第2 2步和第步和第3 3步同時(shí)進(jìn)行，允許混合加入，其形步同時(shí)進(jìn)行，允許混合加入，其形成的免疫復(fù)合物，基本不影響目測(cè)的結(jié)果，適用于目測(cè)結(jié)果成的免疫復(fù)合物，基本不影響目測(cè)的結(jié)果，適用于目測(cè)結(jié)果。二步法二步法 如圖中第如圖中第2 2

10、步和第步和第3 3步由于分步進(jìn)行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主步由于分步進(jìn)行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主要用于需要定量檢測(cè)時(shí)。要用于需要定量檢測(cè)時(shí)。3.3.方法方法加樣：每組加樣：每組7 7微孔，待檢微孔，待檢4 4孔，空白對(duì)照孔，空白對(duì)照1 1孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各1 1孔。分別加陰、陽(yáng)性對(duì)照孔。分別加陰、陽(yáng)性對(duì)照1 1滴和滴和50ul50ul待測(cè)樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置待測(cè)樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。加酶：除空白對(duì)照孔外，每孔加加酶：除空白對(duì)照孔外，每孔加1 1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。洗滌：用洗滌液（按說(shuō)明配制）注滿各孔，靜置洗滌：用洗滌液（按說(shuō)明配制）注滿各孔，靜置2020秒，甩去洗秒，甩去洗滌液，重復(fù)滌液，重復(fù)4 4次，