細胞生物學(xué)實驗報告染色體的觀察山東大學(xué)匯總

1、一、實驗名稱小鼠染色體標本的制備、觀察二、實驗?zāi)康?、熟悉動物生殖細胞減數(shù)分裂過程及各個時期特點。2、掌握小鼠睪丸減數(shù)分裂標本的制作方法。3、學(xué)習染色體的染色和觀察過程。三、實驗原理1、染色體 染色體是細胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的遺傳物質(zhì)深度壓縮形成的聚合體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體（染色質(zhì)）。染色體的分析往往是選擇細胞處于活躍增殖狀態(tài)，或者經(jīng)過各種處理后細胞進入分裂的動物組織。2、細胞分裂及其觀察 細胞的有絲分裂可以大體分為五個階段：前期、前中期、中期、后期、末期，每一個時期都有它特定的形態(tài)和行為特征。 分裂前期：染色體凝集，間期細長、彌散分布的線性染色質(zhì)，經(jīng)過進一步螺旋化、折疊和包裝等過

2、程，逐漸變短變粗，形成光鏡下可辨的早期染色體結(jié)構(gòu)。隨著染色質(zhì)的凝集，核仁縮小消失。分裂極確立: 復(fù)制了的中心體分離，向兩極移動。紡錘體裝配：從中心體形成星體微管和極微管。 前中期：核膜崩解；紡錘體完成裝配，前期星體的形成和向兩極的運動標志著紡錘體組裝的開始。隨著核膜的解體，由紡錘體兩極發(fā)出的一些星體微管可進入“核”內(nèi)，通過其正極端捕獲染色體，形成動粒微管。至此，紡錘體基本完成組裝；染色體整列，在動粒微管的作用下，染色體列隊到赤道板。 中期：染色體排列在赤道板上，也是該實驗的重點觀察時期。 后期：姐妹染色單體分離并向細胞兩極移動。后期A，動粒微管變短，牽動染色體向兩極運動；后期B，極微管長度增加

3、，兩極之間的距離逐漸拉長。 末期：兩子細胞核形成，染色體去濃縮，核膜重建，核仁重現(xiàn)。 在正常動物體內(nèi)，骨髓和睪丸是處于不斷分裂的組織。給動物注射一定劑量的秋水仙素即可使許多處于分裂的細胞停滯于中期，然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體，即可得到大量可分析的染色體標本。在動物實驗時，可在取材前經(jīng)腹腔注射有絲分裂抑制劑，一般常用秋水仙素，這此方法對于動物的核型分析是非常有用的。本方法簡便、可靠，不需要經(jīng)體外培養(yǎng)和無菌操作，易于推廣。因此睪丸和骨髓細胞是用于動物細胞遺傳學(xué)研究很好的材料。3、睪丸睪丸是雄性生殖細胞發(fā)育和成熟的部位，是產(chǎn)生精子的器官。睪丸內(nèi)的曲細精管從外到內(nèi)一次分布有精原細胞、初級精母細胞

4、、次級精母細胞、精子細胞以及形態(tài)漸變中的精子。取睪丸將曲細精管內(nèi)的細胞沖出后固定，然后制片染色，可以觀察到動物生殖細胞減數(shù)分裂染色體的不同時相。如果提前給動物腹腔注射秋水仙素溶液，可以抑制生殖細胞的正常分裂，增加中期分裂相細胞的數(shù)目，此方法可用來進行減數(shù)分裂過程中染色體的計數(shù)與觀察。睪丸染色體標本的制備，可用來檢測雄性個體生殖細胞是否受到周圍環(huán)境污染或是否發(fā)生病變，是小型動物生殖學(xué)常規(guī)實驗。4、倒置染色法在玻璃板上用廢舊玻璃板作支架，使得標本載玻片的正面朝下放置到支架上，在玻璃板和標本載玻片之間滴加Giemsa染液，這樣，一可以節(jié)省染料，二可以防止染料快速揮發(fā)，三可以防止染色顆粒沉淀影響觀察。

5、在操作時應(yīng)注意，多個樣品同時染色應(yīng)擺放緊密，不要有間隙。滴染液時應(yīng)盡量慢，不要有氣泡，以免部分染色體不著色，影響觀察。三、實驗材料1、材料 68周齡，2030g的雄性小鼠2、試劑（1）0.85%氯化鈉溶液（2）0.02%秋水仙素溶液，4保存（3）0.4%KCl溶液（4）卡諾氏固定液 無水乙醇：無水乙酸=3:1（5）1/15 mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.8）（6）Giemsa 染液3、器材離心機、鑷子、解剖盤、載玻片、玻璃板、小燒杯、普通光學(xué)顯微鏡、解剖剪、銅網(wǎng)、滴管、離心管等。四、實驗步驟染色體標本的制備：1、取雄性小鼠以每克體重4注射秋水仙素，經(jīng)1416小時后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸

6、用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污。2、放入裝有1ml 0.3%KCl液的小燒杯中剪碎，至溶液呈乳白色，使細胞分散。用銅網(wǎng)過濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml。3、37靜置30分鐘，進行低滲處理。（整個過程控制在50分鐘內(nèi)）1000 r/min 離心8分鐘。棄上清液，加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹氣，輕輕打散細胞，固定8分鐘。4、再以8001000 r/min離心8分鐘。棄上清液，加1ml固定液，再制成細胞懸液，固定5分鐘。5、取潔凈的低溫預(yù)冷載玻片，距載片1015cm高度滴下23滴細胞懸液（使細胞分散），從載玻片一邊向另一邊輕輕吹氣，并同時輕輕敲打載

7、片，以使細胞均勻分布和促使染色體展開。6、將玻片放置在標本盒中空氣干燥。染色體標本的觀察：1、染色：倒置染色法用 Giemsa液染色20 30分鐘，細水沖洗玻片背面，擦去多余染液，干燥。2、鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的位于分裂中期的分裂相，高倍鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。五、實驗結(jié)果31個38個40個 40個六、結(jié)果分析本次實驗，結(jié)果極為模糊，較為失敗。1、在自己制片中，沒有明顯的呈現(xiàn)出“V”或“U”形的染色體集合，有的是藍色背景上模糊的染色體棒狀，大多數(shù)細胞已經(jīng)成為碎片。分析原因可能有：（1）離心過程中，離心速度過快，導(dǎo)致細胞緊密的黏在一起，很難吹散。（2）在吹散細胞的過程中，力度太

8、大，導(dǎo)致細胞破裂，染色體流出。（3）在摔碎細胞時，滴加高度太小，細胞沒有摔碎。（4）在桌面上敲打細胞時，力度太小，仍有細胞沒有破裂。2、在觀察師兄師姐的裝片時，發(fā)現(xiàn)有的染色體數(shù)目多于40條，有的少于40條，分析其原因可能是： （1）染色體數(shù)目多于40 不同的細胞具體太近，染色體混合，導(dǎo)致數(shù)目過多； 細胞分布太密集，導(dǎo)致染色體與其他細胞的染色體上下重合，在顯微鏡下無法分辨清晰；（2）染色體數(shù)目少于40 吹打過程中，細胞輕微破裂，部分染色體流失； 摔打過程中，細胞也有可能發(fā)生部分染色體被摔離的現(xiàn)象； 在倒置染色、清洗染液的過程中，部分染色體被洗掉； 染色過程中，有的染色體沒有著色，無法觀察到。七、

9、注意事項1、自加入0.3%KCl始，至離心，整個過程應(yīng)注意控制時間，盡量保持在45-50min之內(nèi)。低滲處理是為了使細胞變大易于觀察，但低滲時間過長會使細胞破裂。2、破碎睪丸時，可先加入少量KCl，方便剪碎。破碎差不多后再加入剩下的KCl，先加入的KCL量一定要少，否則不易剪碎。3、操作過程中應(yīng)注意動作不可過大，因為低滲處理的細胞體積變大，更易破碎。4、滴片前應(yīng)盡量輕輕混勻懸液，使細胞分開。5、滴片時，應(yīng)保證玻片在低溫狀態(tài)下。6、采用倒置染色法，可以防止染液蒸發(fā)，同時使染色更加均勻。八、討論1、固定的目的是什么？（1）迅速防止細胞死亡后的變化，如自溶、腐敗等，盡量保持生長狀態(tài)結(jié)構(gòu)。（2）使細胞

10、中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前的形態(tài)； （3）使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定；（4）使不同組織成分對燃料有不同的親和力。便于染色；（5）防止細胞過度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2、秋水仙素抑制細胞分裂的原理是什么？紡錘絲的作用是將分裂的染色體拉向細胞兩極，然后細胞中間自動形成細胞板，最后變成兩個細胞。使用秋水仙素后，紡錘絲的合成被抑制，尤其是動粒微管被破壞。在后期染色單體分裂后，沒有紡錘絲，不能被拉向細胞兩極，細胞就不分裂，停留在分裂中期階段。 九、拓展1、染色體相關(guān)疾病 （1）21三體綜合征（又稱先天愚型或唐氏綜合征）患者核型多數(shù)為47。主要臨床

11、特征是智力低下，發(fā)育遲緩，寬眼距，外眥上斜，內(nèi)眥贅皮，上腭弓高聳，常張口弄舌，掌紋呈通貫手和軸三叉夾角大于65，拇趾球區(qū)脛側(cè)弓狀紋，某些患者伴有先天性心臟病。（2）特納氏綜合癥（Turner）常見的女性性染色體異常疾病。常見的核型是45+X，少數(shù)是嵌合體，出生率1/25001/5000。身材矮小，原發(fā)性閉經(jīng)，性幼稚，蹼頸，后發(fā)際低，寬乳距，肘外翻是本病的主要臨床特征。（3）克氏綜合征（Klinefelter Syndrome）常見的男性性染色體異常疾病，典型的核型為47+XXY。表型特征有睪丸發(fā)育不全。身材修長，乃足跟至趾骨間的距離增長所致。男子乳腺發(fā)育、陰毛呈女性型分布，陰莖及睪丸均小。嚴重

12、者伴有智力遲鈍、隱睪及尿道下裂等。本病發(fā)生率較高，在新生活嬰中的發(fā)生率是1.42.9%，是男性不育癥中常見的一種。（4）愛德華綜合征Edwards染色體異常為18三體。表型特征有智力低下、小頭、前額窄、枕部突、小頜且張口范圍小，腭弓高窄、低位耳、腎畸形、肌張力增高及手緊握等。（5）帕陶綜合征染色體異常為13三體。表型特征中有中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷，呈前腦無裂畸形。前額小呈斜坡樣，頭皮后頂部常有缺損。視網(wǎng)膜發(fā)育不良，切片鏡下觀察可見菊形團形成。嚴重智力低下，唇裂及腭裂、多指等。中性粒細胞核上有過多的突起。（6）貓叫綜合征（5P-綜合征）染色體異常為5號染色體短臂部分或全部缺失。表型特征有：嬰兒時期

13、哭聲似貓叫，因而得名，可有喉器小和會厭小等喉部發(fā)育異常。嚴重智力低下，小頭、圓形臉、眼距寬、眼裂下斜、耳位低、內(nèi)眥贅皮，貫手等多種畸形，約一半患者有先天性心臟病，智力低下，生活能力差，常早亡。4P-綜合征類似5P-綜合征，但常常更為加重，還可呈尿道下裂，腭裂、嚴重的精神以及運動障礙，癲癇發(fā)作等，屬少見病例。（7）費城染色體（Ph''）因首見于美國費城（Philadelphia）而命名。系其22號染色體部分長臂接到9號染色體長臂的一種易位。為慢性粒細胞白血病可見到的特殊的染色體異常，但在其他少數(shù)急性白血病中偶可見到。這也是惡性細胞染色體變異中唯一已被公認確實具有恒定變化的染色體變

14、異。目前，針對多種染色體疾病的醫(yī)療手段還不完善，但是染色體疾病作為一種明顯的遺傳性疾病，可以通過優(yōu)生手段進行預(yù)防。比如：對娩出過染色體病患兒的經(jīng)產(chǎn)婦及反復(fù)發(fā)生自然流產(chǎn)和死產(chǎn)的孕婦施行宮內(nèi)診斷；注意環(huán)境保護，加強職業(yè)性防護監(jiān)測；開展遺傳咨詢、積極推行優(yōu)生法，做好婚姻和生育的醫(yī)藥遺傳指導(dǎo)，避免，提倡適齡生育和計劃生育等。2、植物細胞染色體觀察方法 （1）實驗植物和試劑 大蒜根尖、 0.02%秋水仙素；改良苯酚品紅染液；卡諾氏固定液，1N鹽酸；70%酒精；95乙醇；85乙醇；蒸餾水 （2）實驗方法和步驟 取材 先將大蒜浸泡若干小時，然后轉(zhuǎn)入一個墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置25恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待幼根長

15、至12cm時，于上午911時剪下根尖。 預(yù)處理 將剪下的根尖放進裝有0.02%秋水仙素溶液的燒杯中，浸泡處理34小時。固定 將經(jīng)過預(yù)處理或沒有預(yù)處理的材料，放到卡諾氏固定液中固定 （固定液的量約為材料的10倍，要求一個容器中所裝的材料不能太多，溫度不能太高）。固定224h后分別在95 和85乙醇中各30min ，再轉(zhuǎn)入70%酒精中，于4冰箱內(nèi)保存，保存時間最好不超過二個月。 去壁解離 取固定好的各種植物根尖，倒去固定液，用蒸餾水漂洗23次，放入1N HCl溶液中60水解812min，再用蒸餾水洗凈。適度的水解分離使材料呈白色微透明，狀似豆腐，以解剖針能輕輕壓碎為好。 后低滲 用吸管小心吸去解離液，用蒸餾水慢慢沖洗35次，最后停留在蒸餾水中浸泡2030min左右。 染色 將根尖放在載玻片中央，用刀片將根冠和伸長區(qū)切除，只留乳白色的分生區(qū)，用鑷子或解剖針將材料輕輕搗碎。滴上一滴改良苯