電化學(xué)生物傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的研究進(jìn)展

1、0引言水和食品中細(xì)菌的檢測(cè)，特別是致病性細(xì)菌的檢測(cè)，對(duì)于控制傳染病、保護(hù)環(huán)境衛(wèi)生和人民群眾身體健康都有著重要的意 義。在水和食品中傳播的各種致病性細(xì)菌中，大腸桿菌是最為普遍的一種。它是人 及各種動(dòng)物腸道中的常居菌，常隨糞便從人及動(dòng)物體內(nèi)排出，廣泛散播于自然界。人 體感染了部分大腸桿菌可引起腹膜炎、出血性腸炎、膽囊炎、闌尾炎和尿道炎等疾 病，嚴(yán)重者甚至死亡12。在衛(wèi)生質(zhì)量的評(píng)價(jià)和控制中，通常采用大腸桿菌作為指示菌，利用對(duì)指示菌的檢測(cè)和控制來(lái)了解水體或食品等 的受污染狀況，從而評(píng)價(jià)其質(zhì)量以保證衛(wèi)生安全。大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包才S多管發(fā)酵法和濾膜法等，存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí) 間長(zhǎng)（一般需要12天才能

2、得到結(jié)果等缺點(diǎn)，難以滿足污染源快速診斷的需要。近年 來(lái),許多基于不同檢測(cè)原理的方法已得到長(zhǎng)足的發(fā)展 ，比如聚合酶鏈反應(yīng)35、免疫 學(xué)檢測(cè)67、質(zhì)譜測(cè)定8、光學(xué)測(cè)定910等等。與傳統(tǒng)方法相比，這些方法具有 一定的優(yōu)勢(shì)，但所需的檢測(cè)時(shí)間仍然較長(zhǎng)。因此，建電化學(xué)/生物傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的研究進(jìn)展程欲曉，金利通*（華東師范大學(xué)化學(xué)系，上海200062摘要:大腸桿菌廣泛分布于自然界中，通常被用來(lái)作為水體系統(tǒng)排泄物污染情況的 指示菌。它是大面積食物中毒的主要原因之一，嚴(yán)重感染者會(huì)引發(fā)敗血癥、腎功能衰竭等危及生命 的并發(fā)癥。電化學(xué)/生物傳感器具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如能在渾濁溶液中操作、選擇性 好、靈敏度高、檢

3、測(cè)速度快等，因此在臨床檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)和食品安全等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該文主要對(duì)電化學(xué)/生物傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的研究進(jìn)展進(jìn)行了 簡(jiǎn)要的綜述。關(guān)鍵詞:大腸桿菌；電化學(xué)/生物傳感器:快速檢測(cè)Development of rapid detection of escherichia coli byelectrochemical sensor and biosensorCheng Yu -xiao,Jin Li -tong *(Department of Chemistry,East China Normal University,Shanghai 200062,ChinaAbstract:Esch

4、erichia coli (E.coli,spreading abroad in natural environment,are commonly used as indicators of fecal contamination in water environments.They are one of the major causes of food-borne outbreaks and can pro -duce life -threatening complications ranging from blood diarrhea to renal failure.Electroche

5、mical sensors and biosensors have more advantages than other methods in that they can operate in turbid media and have good selec -tivity and high sensitivity.Therefore,they are applied widely in clinic diagnostics,environmental protection and food sanitation.This paper reviews briefly the recent de

6、velopment of rapid detection of E.coli by electrochemical sensors and biosensors.Key words:escherichia coli;electrochemical sensor and biosensors;rapid detection基金項(xiàng)目：上海市科委No.06dz05824資助項(xiàng)目*通訊聯(lián)系人，E-mail:ltjin .cnVol.29,No.1Mar .2009化學(xué)傳感器CHEMICALSENSORS第29卷第1期2009年3月立快速檢測(cè)大腸桿菌的新方法成為環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品

7、衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)＜液蛯W(xué)者的一個(gè) 巨大挑戰(zhàn)。電化學(xué)/生物傳感器由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如能在渾濁溶液中操作、選擇性好、靈 敏度高等,在各類傳感器中占著重要的地位。其所測(cè)的信號(hào)通常是電位、電流、電 阻等的變化，可以直接測(cè)量，便于儀器自動(dòng)化、小型化和智能化。近年來(lái)，應(yīng)用各種電 化學(xué)/生物傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的方法紛紛發(fā)展起來(lái) 7,1112。1大腸桿菌及其生物學(xué)特性大腸埃希氏菌簡(jiǎn)稱大腸桿菌，分類于腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏染色陰性直桿菌，因德國(guó)的細(xì)菌學(xué)家Theodor Escherich 在1885年首次分離出來(lái)而得名13。大腸桿菌是兩端鈍圓的短桿菌（如圖1,長(zhǎng)約 2.03.0以況約0.5 m mt時(shí)近似球菌

8、。大部分大腸桿菌通常沒(méi)有致病性，但是部分能產(chǎn)生腸毒素，導(dǎo)致人體腸胃炎等疾 病14。特別是O157型的大腸桿菌會(huì)引起腹瀉、出血性大腸炎和溶血尿毒癥等疾 病。當(dāng)它入侵到腸道外的其它組織器官時(shí)，會(huì)引起尿道炎、膀胱炎、闌尾炎等，對(duì)于 免疫力下降的病人還可引起敗血癥。大腸桿菌的致病物質(zhì)包括侵襲力、內(nèi)毒素和腸 毒素，侵襲力則包含有K抗原和定居因子。K抗原具有抗吞噬、抵抗抗體和補(bǔ)體的 作用。定居因子也稱粘附素，目前已證實(shí)致瀉大腸桿菌的定居因子是一種特殊菌 毛。含有內(nèi)毒素的大腸桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)具有內(nèi)毒素活性，脂多糖層的脂類A是其毒性部位。大腸桿菌的腸毒素是某些大腸桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中釋放出來(lái)的外毒素，這些菌株稱

9、為產(chǎn)毒性大腸桿菌。大腸桿菌是人及各種動(dòng)物腸道中的正常寄居菌，常隨糞便從人和動(dòng)物體內(nèi)排出， 廣泛傳播于自然界，所以環(huán)境中一旦檢出有大腸桿菌的存在，則意味著直接或間接地 被糞便污染了 ；并且由于大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道病原菌相近 ，它的 出現(xiàn)也可能預(yù)示著某些腸道病原菌（如沙門氏菌和志賀氏菌等的存在。因此，從19 世紀(jì)末大腸桿菌被發(fā)現(xiàn)時(shí)，就開(kāi)始被廣泛用作飲用水、牛奶或食品等的糞源性污染 衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在環(huán)境學(xué)上也被廣泛用作各種水體的細(xì)菌學(xué)指標(biāo) 15 o2電化學(xué)/生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌的進(jìn)展2.1電流型化學(xué)/生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌電流法（又稱安培法是電化學(xué)傳感器最常采用的一種檢測(cè)方法。它的檢

10、測(cè)原理是當(dāng)工作電極的電位設(shè)定在一定值時(shí)，被測(cè)物直接或者間接的在電極表面產(chǎn)生電流，從而可以定量分析被測(cè)物。大腸桿菌本 身在電極表面不能直接進(jìn)行電子傳遞。因此，需要氧化還原介質(zhì)，根據(jù)氧化還原介質(zhì) 產(chǎn)生的電流大小與大腸桿菌的濃度成一定的關(guān)系，間接地檢測(cè)大腸桿菌。該文課題組制備了新型納米二氧化錫電極，用該電極作為工作電極，采用計(jì)時(shí)電 流法對(duì)水體中大腸桿菌進(jìn)行了快速計(jì)數(shù)研究16。由于水分子在納米二氧化錫電極表面電解產(chǎn)生的 OH能夠引起大腸桿菌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧 化,從而在電極上產(chǎn)生氧化電流，根據(jù)氧化電流變化與大腸桿菌數(shù)量的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì) 大腸桿菌快速檢測(cè) 檢測(cè)限可達(dá)1X103cfu/mL。止匕外，通過(guò)大腸桿

11、菌脂質(zhì)過(guò)氧化后丙 二醛含量的檢測(cè)，對(duì)大腸桿菌在納米二氧化錫電極上的電化學(xué)響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了初步 的探討。該文課題組制備物納米修飾電極，用于流動(dòng)注射法快速安培檢測(cè)大腸桿菌17 o 在培養(yǎng)過(guò)程中大腸桿菌產(chǎn)生葡萄糖醛酸酶，該酶與底物反應(yīng)后產(chǎn)生4-硝基酚。鈿納 米修飾電極對(duì)4-硝基酚具有較高的靈敏度，產(chǎn)生的電流響應(yīng)與細(xì)菌的濃度成正比，從 而實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的快速檢測(cè)。大腸桿菌濃度在1994-2010Academic Journal Electronic Publishing House.1.5 1021M06cfu/mL 與電流響應(yīng)圖1大腸桿菌的透射電鏡圖Fig.lTEM image of E.coli化學(xué)

12、傳感器29卷4成正比，檢測(cè)限達(dá)100cfu/mL,總分析時(shí)間為3h。該文課題組還制備了多種化學(xué)/生物傳感器，并基于檢測(cè)半乳糖甘酶的活性來(lái)快 速檢測(cè)水體中的大腸菌群1821。例如，課題組基于Fe3O4磁性納米顆粒-碳納米管 復(fù)合材料構(gòu)筑了一種新型的酪氨酸酶生物傳感器，并將其應(yīng)用于大腸菌群的快速檢 測(cè)20。細(xì)菌產(chǎn)生的半乳糖甘酶與底物苯基-&D-叱喃半乳糖甘反應(yīng)產(chǎn)生苯酚，然后， 采用酪氨酸酶生物傳感器快速檢測(cè)苯酚。大腸桿菌的濃度在2X1011X105cfu/mL范圍內(nèi)與電流響應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，具檢測(cè)限可達(dá)10cfu/mL。電化學(xué)阻抗譜是一種研究導(dǎo)電材料以及界面性質(zhì)的有效手段，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用

13、于電化學(xué)傳感器的開(kāi)發(fā)。對(duì)于一個(gè)阻抗特性的傳感器，其電容、電感和電阻特性的 組合會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特定的阻抗信號(hào)；如果傳感器周圍環(huán)境發(fā)生變化引起上述特性的任 何變化，都會(huì)造成阻抗的改變，將得到一系列新的阻抗特性，這就是基于電化學(xué)阻抗技 術(shù)的傳感器的研究基礎(chǔ)。電化學(xué)阻抗生物傳感器用于細(xì)菌的快速檢測(cè)具有較好的選擇性，而且與其它的 電化學(xué)方法相比，這種方法不需要標(biāo)志物，簡(jiǎn)化了傳感器的制備。Li領(lǐng)導(dǎo)的工作小組 在電化學(xué)阻抗技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌方面已取得很多優(yōu)秀的成果2225 o如他們制備了無(wú)標(biāo)志物的叉指微電極阻抗傳感器用于檢測(cè)大腸桿菌O15722,細(xì)菌吸附于ITO微電極表面，從而導(dǎo)致了電極阻抗發(fā)生變化，大腸桿菌的濃

14、度在4.36 X05到 4.36 108cfu/mL范圍內(nèi)與阻抗的變化值成正比。止匕外，他們把金叉指電極固定于微 流動(dòng)裝置里，采用納米磁珠分離牛肉中的大腸桿菌，將分離出的細(xì)菌溶液注入微流動(dòng) 裝置里，通過(guò)檢測(cè)電極交流阻抗的變化來(lái)測(cè)定大腸桿菌的濃度，能在35min內(nèi)檢測(cè)出160cfu/mL 大腸桿菌23 o該文課題組在金電極表面組裝了琉基乙酸，通過(guò)碳二亞酰胺法把大腸桿菌抗體 固定在金電極表面，從而制備一種新型的電化學(xué)阻抗免疫傳感器 26。把Fe(CN63- /Fe(CN64-作為氧化還原探針，考察了大腸桿菌特異性吸附到該免疫傳感器引起的阻 抗變化值，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的快速檢測(cè)。并把該生物傳感器應(yīng)用

15、于河水樣品的檢 測(cè),最低能檢測(cè)出50cfu/mL的大腸桿菌。電化學(xué)阻抗生物傳感器具有容易制備、成本低、易于封裝和快速等特點(diǎn)，因此在食品的微生物檢測(cè)中具有良好的前景。盡管如此，阻抗傳感器的檢測(cè)限與傳統(tǒng)方 法相比仍比較高，而且及樣品的分析系統(tǒng)還不夠完善，因此需要大量的工作使這種技 術(shù)更加成熟。2.3DNA電化學(xué)生物傳感器應(yīng)用于大腸桿菌的檢測(cè)近年來(lái)，各種靈敏的DNA或RNA電化學(xué)生物傳感器已廣泛應(yīng)用于環(huán)境中細(xì) 菌、病毒和各種化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)2731。DNA生物傳感器設(shè)計(jì)的依據(jù)就是核酸雜交動(dòng)力學(xué)，因此確切來(lái)說(shuō)它該是核酸雜交生物傳感器的簡(jiǎn)稱。DNA電化學(xué)生物傳感器是DNA生物傳感器中的一種，是由固定了單鏈

16、DNA(ssDNA的電極和電化學(xué)活性 識(shí)別元素構(gòu)成。為了提高雜交的專一性，ssDNA片段長(zhǎng)度范圍一般從十幾個(gè)堿基到 幾十個(gè)堿基，通常采用人工合成的短的寡聚脫氧核甘酸，其堿基序列與樣品中的靶序 列互補(bǔ)。首先將ssDNA片段固定到電極表面，在適當(dāng)?shù)臏囟取H值和離子強(qiáng)度條 件下同定在電極上的ssDNA與雜交緩沖溶液中的靶基因發(fā)生選擇性雜交反應(yīng)。如 果樣品中的DNA片段出現(xiàn)不互補(bǔ)的堿基，在電極表面就不能形成雙鏈雜交分子 (dsDNA;如果樣品中含有完全互補(bǔ)DNA片段，則在電極表面形成dsDNA,從而導(dǎo)致 電極表面結(jié)構(gòu)的變化，然后通過(guò)檢測(cè)電極表面的電活性識(shí)別元素的電信號(hào) ，達(dá)到識(shí)別 和測(cè)定靶基因的目的

17、。每個(gè)種屬生物體內(nèi)都含有其獨(dú)特的核酸序列，因此檢測(cè)核酸關(guān)鍵是設(shè)計(jì)一段寡 核甘酸探針，探針一般由1030個(gè)堿基對(duì)組成，是一段單鏈核酸分子，能夠?qū)Ｒ坏嘏c特 定靶序列進(jìn)行雜交32,從而檢測(cè)出特定的生物種屬。雜交過(guò)程具有很高的特異性和 敏感性，這是核酸檢測(cè)研究的基礎(chǔ)，也是設(shè)計(jì)DNA生物傳感器首要和基本的條件。 把DNA電化學(xué)生物傳感器應(yīng)用于大腸桿菌的檢測(cè)已有很多文獻(xiàn)報(bào)道3335。Baeumner等33制備DNA生物傳感器能在1520min內(nèi)快速、靈敏地檢測(cè) DNA的 濃度;通過(guò)檢測(cè)大腸桿菌提取和純化后的 DNA濃度，對(duì)水體中大腸桿菌的濃度進(jìn)行 定量檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)40cfu/mL。Arora等35程欲

18、曉等：電化學(xué)/生物傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的研究進(jìn)展1期5制備了生物親和素聚苯胺修飾鋁電極，并且把帶有生物素的DNA探針通過(guò)親和 素-生物素系統(tǒng)的作用力固定于聚苯胺修飾電極上。首先將大腸桿菌經(jīng)過(guò)超聲后把 目標(biāo)DNA片段提取出來(lái)，然后把亞甲基藍(lán)作為指示劑、采用聚苯胺 DNA傳感器來(lái) 檢測(cè)大腸桿菌溶液的互補(bǔ) DNA片段，在14min內(nèi)能檢測(cè)出11cfu/mL的大腸桿菌。微生物在加入一定氧化還原介質(zhì)后，能把代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)轉(zhuǎn)化成電 信號(hào)。目前，已報(bào)道許多電化學(xué)傳感器根據(jù)檢測(cè)代謝產(chǎn)物來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行快速分析 3642。這些技術(shù)都是基于直接檢測(cè)電化學(xué)傳感器上的一些物理量的變化來(lái)檢測(cè) 細(xì)菌的，例如pH

19、、耗氧量、離子濃度、電壓和電阻等電參量的變化。Fidel等43在大腸菌群溶液中加入兩種還原的介質(zhì)(K3Fe(CN6和2,6- dichlorophenolindophe-nol,大腸桿菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生葡萄糖脫氫酶可以還原這兩 種介質(zhì)，通過(guò)流動(dòng)注射分析法檢測(cè)兩種介質(zhì)在細(xì)菌代謝過(guò)程中電流響應(yīng)的變化值從 而檢測(cè)大腸桿菌。這種方法檢測(cè)時(shí)間需2h,檢測(cè)限可達(dá)1.0M05cfu/mL。大腸桿菌在代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶44,該酶可以分解過(guò)氧化氫。Sippy等人45采 用Clark型的電化學(xué)傳感器檢測(cè)大腸桿菌代謝過(guò)程中消耗過(guò)氧化氫的量，可以快速檢 測(cè)出2.0 M012.0X07cfu/mL范圍內(nèi)的大腸

20、桿菌。此外，大腸桿菌在有氧代謝的情況中加入水楊酸后可產(chǎn)生多元酚。該文課題組 46制備了雙酶電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)多元酚的濃度，檢測(cè)所得的電流信號(hào)與大腸桿菌的濃度在1.6X03 1.0 107cfu/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢測(cè)過(guò)程需3 h,最低檢 測(cè)限達(dá)1000cfu/mL?；谖⑸锎x產(chǎn)物檢測(cè)大腸桿菌的方法快速、方便，但尚存在靈敏度低、選擇性差等缺點(diǎn)。3展望電化學(xué)/生物傳感器所需要的儀器簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)微型化，因此在大腸 桿菌的快速檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，要對(duì)這些檢測(cè)大腸桿菌的傳感器進(jìn) 行商業(yè)化還存在一些應(yīng)用上和技術(shù)上的難度。首先，要求傳感器對(duì)樣品的細(xì)菌具有選擇性，且檢測(cè)的

21、速度快，細(xì)菌不需要預(yù)培養(yǎng)。此外，在分析實(shí)際樣品中需要很高的檢 測(cè)靈敏度，比如說(shuō)飲用水的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是每1L飲用水不得檢出超過(guò)3個(gè)大腸桿菌。因 此,就要求制備的電化學(xué)/生物傳感器的靈敏度達(dá)3cfu/L,且檢測(cè)的耗費(fèi)比較低，這樣的 傳感器才有商業(yè)化的價(jià)值。這些都是有待今后要進(jìn)一步研究解決的問(wèn)題。參考文獻(xiàn)1Altekruse S F,Cohen M L,Sherdlow D L.EmergingFoodborne DiseasesJ.Emerg.Infect.Dis.,1997,3(3: 285293.2Wang J,Rivas J,Cai X.Screen-printed electrochemica

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