自學自講(基因敲除)

1、基 因 敲 除技術及其應用Your site hereContents基因敲除的步驟及方法基因敲除的步驟及方法2基因敲除的定義基因敲除的定義1基因敲除的應用基因敲除的應用34Your site hereSub title基因敲除的定義 基因敲除基因敲除 ( Gene knockout) 是指一種遺是指一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出并可進一步對生物體造成影響

2、，進而推測出該基因的生物學功能。該基因的生物學功能。Your site here基因敲除的基本步驟 第一步：第一步：E S E S 細胞的獲得細胞的獲得 第二步：重組載體的構建第二步：重組載體的構建 第三步：重組第三步：重組DNADNA轉入受體細胞核內轉入受體細胞核內 第四步：目的細胞的篩選第四步：目的細胞的篩選 第五步：轉基因動物的獲得第五步：轉基因動物的獲得 Your site here基因敲除的方法一C r e - L o x P系統(tǒng) C r e -L o x P 系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體, 但是具有了時空調控的功能 。它由 C r e 重組酶和 L o x P位點兩部分組成。 C r

3、 e -L o x P 系統(tǒng)可以實現(xiàn)對基因的不同發(fā)育階段、 不同組織類型中特異性的刪除 , 可以消除由于基因位置改變造成的影響, 加強了對基因的控制能力, 使研究者可以更方便地有針對性地進行目標階段的研究工作;C r e -L o x P系統(tǒng)可以實現(xiàn)染色體間的基因重排;但同時也可以看出該系統(tǒng)對基因的了解要求極高, 并且對基因片段的操作能力要求也很高, 基因片段的大小通常在 10 k b 以上, 這些都不利于研究工作進行。Your site here基因敲除的方法二轉座子系統(tǒng) 轉座子系統(tǒng)自從 20世紀 50年代被 Mc C l i n t o c k 發(fā)現(xiàn)以來, 已經(jīng)成為許多組織器官進行基因分析

4、的工具 。在人和小鼠的基因組中, 轉座子衍生序列多達整個基因組的40 %, 這提示在發(fā)育過程中轉座子有重要作用 。 轉座子系統(tǒng)易于操作 , 所需時間短 , 具有高通量的特點 ,可以攜帶多種抗性標記 , 方便了同時進行多基因功能研究。但其應用范圍有限, 適用于有一段克隆到的原始基因組序列, 長度在 10 15 k b , 且轉座子應滿足以下條件 :轉座子本身應該很短, 易于操作, 并對任何期望敲除區(qū)域有高效率;在刪除目的區(qū)域后應留下足夠長的兩臂用于同源重組。這些都限制了轉座子的應用。Your site here基因敲除的方法三基因捕獲載體系統(tǒng)基因捕獲技術是將突變基因導入小鼠 E S細胞從而獲得小

5、鼠基因組文庫 , 進行小鼠基因組的功能研究 , 它屬于大規(guī)模隨機敲除。典型的基因捕獲載體通常包括一個無啟動子的報道基因, 并通過調控元件使含有小鼠基因組文庫的 E S 克隆很容易被選擇性培養(yǎng)基篩選出來。Your site here基因敲除的方法四 H i t 和 R u n 法 H i t 和 R u n 法也稱進退策略 。它包括兩次同源重組 :第一步 ( H i t )用插入型載體進行同源重組 , 在靶位點插入帶有突變的基因組序列以及帶有兩個篩選標記 ( 如 n e o 和 t k )的載體序列 ;第二步 ( R u n )利用 t k 抗性篩選 , 富集發(fā)生去除了含有負篩選標記基因的載體序

6、列的回復突變的克隆 。 H i t 和 R u n法的不足之處是 :無法精確控制染色體內的同源重組 , 可能會失去攜帶突變的同源序列 , 而保留未修飾的內源片段 ;整個過程需要采用兩種培養(yǎng)基分別進行先后兩次篩選 ;無法同時引進多個位點突變 。Your site here基因敲除的方法五 . 雙置換法 雙置換法也屬于精細突變敲除 。它首先用含有 H p r t 基因的打靶載體轉染H p r t - E S 細胞 , 通過在次黃嘌呤 、 氨喋呤和脫氧胸腺嘧啶苷培養(yǎng)基中篩選并用 P C R進行基因組分析 , 篩選發(fā)生同源重組 、 H p r t 基因陽性克隆 。然后用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉染

7、上一步獲得的 H p r t +E S 細胞 。同源重組發(fā)生后 , 突變序列將 H p r t 置換出來 。 這種方法的優(yōu)點在于 , 第一步獲得的 H p r t +E S 細胞 , 除了可用于產(chǎn)生普通的基因剔除小鼠外 , 也可以作為將不同突變引入靶基因的基礎 。Your site here基因敲除的研究和應用1. 1 在人類疾病動物模型方面的應用1. 2 基因和蛋白功能研究方面的應用1. 3 藥物依賴性研究方面的應用1. 4 毒理學研究方面的應用1. 5 免疫學方面的應用1. 5 免疫學方面的應用1. 6 治療措施研究方面的應用Your site here 在人類疾病研究方面的應用 人類幾乎

8、所有的疾病都與基因有關, 基因敲除動物模型的建立, 為研究人類疾病提供了一個嶄新方法 ,尤其是遺傳性疾病。OA1(眼球白化癥 , ocularalbinism)是一種基因紊亂遺傳性疾病 , 能引起視力嚴重下降 ,斜視 、光恐怖、眼球震顫 。 Incerti3 通過敲除法去除小鼠 OA1 基因 ,眼科檢查顯示眼球底部黑色素不足 , 臨床癥狀表現(xiàn)與人的相似 , 從而用來研究 OA1 的發(fā)病機制。Your site here在基因和蛋白功能研究方面的應用 klotho( kl) 基因是 Matsumura 等在研究自發(fā)型高血壓時發(fā)現(xiàn)的與衰老有關的新基因 7 。 kl 基因主要在腎臟和腦表達 ,其表達

9、產(chǎn)物有膜結合型和分泌型兩種蛋白異構體形式, 二者可能分別是膜結合受體和體液調節(jié)信號蛋白 。kl 基因敲除小鼠過早出現(xiàn)和人類衰老相關的多種行為和病理生理改變, 如壽命縮短、運動失調、性功能障礙、癡呆、白內障、動脈粥樣硬化 、肺氣腫 、骨質疏松 、免疫功能降低等 8 。Your site here藥物依賴性研究方面的應用 利用基因敲除技術可以選擇性敲除某一特定受體基因, 獲得先天缺失該受體基因的動物, 通過比較基因缺失動物和野生型動物在依賴性模型上的行為差別,可以準確判斷該受體所發(fā)揮的作用。阿片受體是阿片類物質直接作用的受體, 不僅在介導阿片類鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用 ,而且也與精神活性藥物的依賴性有關

10、。Your site here毒理學研究方面的應用 金屬硫蛋白( MT) 是細胞內富含半胱氨酸巰基( SH) 的小分子蛋白, 目前認為 MT 具有調節(jié)細胞內鋅和銅等功能性金屬離子的體內穩(wěn)態(tài) 、拮抗有害重金屬毒性 、捕獲自由基、抗過氧化應激 、抗凋亡和參與細胞生長調節(jié)等功能17 。利用MT 基因敲除小鼠還可進一步觀察多環(huán)芳烴化合物免疫毒性機制與MT 之間的關系。另有研究選用MT 基因敲除小鼠和野生型小鼠對 DMBA 的免疫毒性反應進行了觀察比較 , 結果發(fā)現(xiàn) DMBA 對MT 基因敲除的動物所造成的免疫損傷比含有 MT的動物要明顯嚴重, 提示 MT 對 DMBA 的免疫毒性具有明顯的保護作用 。

11、Your site here免疫學方面的應用 近年來,在免疫學方面出現(xiàn)了幾十種免疫分子基因敲除動物模型, 將免疫學研究特別是免疫耐受的研究推到一個新的階段 。例如: TCR 基因敲除后 ,小鼠胸腺發(fā)育不全, 脾中 B 細胞增多; 免疫球蛋白 u鏈基因被敲除后 ,B 細胞發(fā)育受阻 ; MHC I 和 II 類抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 細胞; 2 微球蛋白基因敲除后缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 細胞 ;RAG 重組酶基因被敲除后 ,出現(xiàn)免疫球蛋白重排障礙等18 。Your site here 治療措施研究方面的應用 載脂蛋白 E( ApoE) 基因敲除小鼠是目

12、前在動脈粥樣硬化( AS)治療研究領域中應用最多的基因工程動物 。若干研究表明, 通過正常體細胞基因轉移治療, 可以延緩 ApoE 基因敲除小鼠 AS 病變的發(fā)展。內抑素是近年來發(fā)現(xiàn)的有效的血管新生抑制劑,Moulton 和 Kruger 19 , 20 發(fā)現(xiàn)通過大劑量持續(xù)注射內抑素全組蛋白能夠有效的抑制 ApoE 基因敲除鼠AS 斑塊的發(fā)展。實驗證明, 將正常小Your site here 治療措施研究方面的應用 鼠的骨髓移植到 ApoE 基因敲除小鼠后, 其血清中即可發(fā)現(xiàn) ApoE, 而血漿清除脂蛋白的能力明顯增強,血清膽固醇亦達到正常水平。故認為骨髓移植是防止飲食所致小鼠 AS 的有效措

13、施。Your site here 治療措施研究方面的應用 人類器官移植在人類疾病治療中起舉足輕重的作用, 但有兩大問題一直未得到解決 : 一是器官來源,目前器官來源主要是尸體 ,受到時間和運輸?shù)葪l件的限制 ,在有些地方還涉及到宗教的問題; 二是器官移植的免疫排斥反應?；蚯贸齽游锬Ｐ涂赡軙鉀Q這兩個難題 。Kuwaki 等采用基因敲除法 ,將引起超Your site here 治療措施研究方面的應用 急性排斥反應的半乳糖轉移酶基因敲除, 用此方法培育的動物的器官可以移植到人體而無排斥反應。他們已成功培育半乳糖轉移酶基因敲除豬, 且已經(jīng)開展了將該基因敲除豬的心臟移植至狒狒體內的實驗,經(jīng)移植后的狒

14、狒存活了 2 -6 個月( 均值為 78天),且均未出現(xiàn)超急性排斥反應的表現(xiàn)。Your site here參考文獻 1 陳系古, 都同功.基因打靶技術在轉基因動物中的進展 J .中國實驗動物學雜志. 1997, 7: 47-50. 2 黃冰, 黃文革, 陳系古, 等.小鼠胚胎干細胞在六種培養(yǎng)體系的培養(yǎng)觀察 J . 中國實驗動物學報, 2000, 8: 1-6. 3 Incerti B , Cortese K, Pizzigoni A, et al.Oa1 knock-out :newinsights on the pathogenesis of ocular albinism type 1 J

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