08酶工程制藥

1、08 08 酶工程制藥酶工程制藥S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述S2 S2 固定化酶與固定化細胞固定化酶與固定化細胞S3 S3 酶的化學修飾酶的化學修飾S4 S4 酶工程研究的進展酶工程研究的進展S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶工程的概念酶工程的概念酶工程（酶工程（enzyme engineeringenzyme engineering）是是酶學酶學和和工程學工程學相互滲透發(fā)展而成的一門新的技術(shù)相互滲透發(fā)展而成的一門新的技術(shù)科學，它是從應用的目的出發(fā)研究酶、應科學，它是從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶的特異性催化功能，并通過工程化將用酶的特異性催化功能，并通過工程化將相應原料轉(zhuǎn)

2、化成有用物質(zhì)的技術(shù)。相應原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶工程的研究內(nèi)容酶工程的研究內(nèi)容（1 1）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及應用開發(fā)）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及應用開發(fā)（2 2）酶和細胞的固定化酶和細胞的固定化及酶傳感器的研究及酶傳感器的研究（3 3）基因工程酶、遺傳修飾酶（突變酶）基因工程酶、遺傳修飾酶（突變酶）（4 4）酶的分子改造與）酶的分子改造與化學修飾化學修飾、酶的結(jié)構(gòu)與功能關系、酶的結(jié)構(gòu)與功能關系（5 5）有機相中的酶反應有機相中的酶反應的研究的研究（6 6）酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)及應用）酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)及應用（7 7）抗體酶、核酶、

3、脫氧核酶抗體酶、核酶、脫氧核酶的研究的研究（8 8）模擬酶模擬酶、合成酶、酶分子的人工設計、合成、合成酶、酶分子的人工設計、合成S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶在醫(yī)藥領域的應用酶在醫(yī)藥領域的應用n在疾病診斷方面的應用在疾病診斷方面的應用（1 1）根據(jù)體內(nèi)原由酶活力的變化來診斷某些疾?。└鶕?jù)體內(nèi)原由酶活力的變化來診斷某些疾?。ㄈ缋霉龋ㄈ缋霉缺D(zhuǎn)氨酶活力升高來診斷肝炎）丙轉(zhuǎn)氨酶活力升高來診斷肝炎）（2 2）用酶測定體液中某些物質(zhì)的量診斷疾?。┯妹笢y定體液中某些物質(zhì)的量診斷疾病（如利用葡萄糖（如利用葡萄糖氧化酶測定血糖含量來診斷糖尿?。┭趸笢y定血糖含量來診斷糖尿?。﹏在疾病治療方面的

4、應用在疾病治療方面的應用藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)n在藥物生產(chǎn)方面的應用在藥物生產(chǎn)方面的應用酶法制藥酶法制藥n在分析檢測方面的應用在分析檢測方面的應用S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥：酶法制藥：是指利用酶的催化作用而制造出是指利用酶的催化作用而制造出具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程。具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程。主要技術(shù)包括主要技術(shù)包括: : 酶的催化反應酶的催化反應 酶的固定化酶的固定化 酶的非水相催化酶的非水相催化酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述青霉素?；福呵嗝顾仵；福?制造半合成青霉素和頭孢霉素制造半合成青霉素和頭孢霉素11-

5、11- - -羥化酶：羥化酶： 制造氫化可的松制造氫化可的松L-L-酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶：酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶：制造多巴制造多巴 - -酪氨酸酶：酪氨酸酶： 制造多巴制造多巴核糖核酸酶：核糖核酸酶： 生產(chǎn)核苷酸類物質(zhì)生產(chǎn)核苷酸類物質(zhì)蛋白酶和羧肽酶：蛋白酶和羧肽酶：將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素酶法制藥：酶法制藥：是指利用酶的催化作用而制造出是指利用酶的催化作用而制造出具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程。具有藥用功效的物質(zhì)的技術(shù)過程。酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述將豬胰島

6、素轉(zhuǎn)化為人胰島素將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述藥用酶的生產(chǎn)：藥用酶的生產(chǎn)：是指生產(chǎn)可用于預防和治是指生產(chǎn)可用于預防和治療疾病的酶。療疾病的酶。主要技術(shù)包括主要技術(shù)包括: : 藥用酶的發(fā)酵生產(chǎn)藥用酶的發(fā)酵生產(chǎn) 藥用酶的分離純化藥用酶的分離純化 藥用酶的分子修飾藥用酶的分子修飾酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥酶法

7、制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)S1 S1 酶工程制藥概述酶工程制藥概述酶法制藥酶法制藥藥用酶的生產(chǎn)藥用酶的生產(chǎn)至至20042004年年2 2月美國月美國FDAFDA批準的生物技術(shù)藥物批準的生物技術(shù)藥物 產(chǎn)品商品名公司首次批準時間適應證Reteplase，t-PA突變體Retavase(大腸桿菌大腸桿菌)Centocor1996.10急性心梗Rasburicase，尿酸降解酶Elitek(酵母酵母)Sanofi-Synthelabo2002.7血漿尿酸癥alteplase, tPAActivase (CHO)Genentech1987.11急性心梗，腦中風，肺栓塞urokinase，尿激酶Abbo

8、kinase(胎腎細胞胎腎細胞)Abbott2002.10肺栓塞Laronidase，粘多糖-L-艾杜糖醛酸水解酶Aldurazyme (CHO)Genzyme2003.4粘多糖貯積病Imiglucerase，葡糖腦苷脂酶Cerezyme (CHO)Genzyme1994.5Gauchers病Algasidase beta，半乳糖苷酶-Fabrazyme (CHO)Genzyme2003.4Fabrys病dornase alfa，DNA酶Pulmozyme (CHO)Genentech1993.12囊性纖維化Tenecteplase，t-PA突變體TNKase (CHO)Genentech20

9、00.6急性心梗S2 S2 固定化酶與固定化細胞固定化酶與固定化細胞n從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶n固定化的方法固定化的方法n固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)n固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶均相酶反應系統(tǒng)的缺點：均相酶反應系統(tǒng)的缺點：1 1、水溶液中的、水溶液中的游離酶游離酶只能一次性使用：既只能一次性使用：既造成酶的浪費，又會增加產(chǎn)品分離的難造成酶的浪費，又會增加產(chǎn)品分離的難度和費用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量度和費用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量2 2、游離酶很不穩(wěn)定，容易變性、失活、游離酶很不穩(wěn)定，容易變性、失活從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性

10、質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化酶的概念：固定化酶的概念：通過載體將酶限制或固定于特定通過載體將酶限制或固定于特定的空間位置，使之既不易隨水的空間位置，使之既不易隨水流失，又能發(fā)揮酶的催化作用，流失，又能發(fā)揮酶的催化作用，這樣的酶制劑就稱之為這樣的酶制劑就稱之為固定化酶固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme），制備固定化酶的過程稱為制備固定化酶的過程稱為酶的酶的固定化。固定化。固定化酶的最大特點：既具有固定化酶的最大特點：既具有生物催化劑生物催化劑的功能，的功能， 又具有又具有固相催化劑固相催化劑的特性。

11、的特性。從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶1 1、可以多次使用，且酶的穩(wěn)定性提高、可以多次使用，且酶的穩(wěn)定性提高固定化的葡萄糖異構(gòu)酶：固定化的葡萄糖異構(gòu)酶：60-6560-65，1000h1000h固定化黃色短桿菌的延胡索酸酶：固定化黃色短桿菌的延胡索酸酶：反應反應1 1年活力不變年活力不變2 2、酶與底物和產(chǎn)物易于分開：、酶與底物和產(chǎn)物易于分開： 產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高固定化酶的優(yōu)點固定化酶的優(yōu)點從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固

12、定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞3 3、反應條件易于控制：、反應條件易于控制： 可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應的連續(xù)化和自動控制可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應的連續(xù)化和自動控制4 4、利用效率高：、利用效率高： 單位酶催化的底物量增加，用酶量減少單位酶催化的底物量增加，用酶量減少5 5、比水溶性酶更適合于多酶反應、比水溶性酶更適合于多酶反應從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化酶的優(yōu)點固定化酶的優(yōu)點從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞連續(xù)的多酶反應連續(xù)的多酶反應主要缺點主要缺點: : 固定化時，酶活力有損失固定化

13、時，酶活力有損失從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞固定化的方法固定化的方法物理法物理法結(jié)晶法結(jié)晶法化學法化學法共價結(jié)合法共價結(jié)合法分散法分散法交聯(lián)法交聯(lián)法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法網(wǎng)格型網(wǎng)格型離子結(jié)合法離子結(jié)合法微囊型微囊型從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞化學法：化學法：共價結(jié)合法共價結(jié)合法n酶與載體以共價鍵結(jié)合酶與載體以共價鍵結(jié)合 使用和報道最多的方法！使用和報道最多的方法！n載體載體 無機物（玻璃、陶瓷）無機物（玻璃、陶瓷） 天然有機物

14、（多糖、蛋白質(zhì)）天然有機物（多糖、蛋白質(zhì)） 合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍）從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞化學法：化學法：共價結(jié)合法共價結(jié)合法n載體載體- -反應基團反應基團 活性基團（活性基團（-SH-SH） 相關基團活化（相關基團活化（-OH-OH、-COOH-COOH、-NH-NH2 2等）等） 雙功能試劑（戊二醛）雙功能試劑（戊二醛）n酶酶- -反應基團反應基團 -/-/- -氨基，氨基， -/-/ -/-/ - -羧基羧基 羥基、巰基、咪唑基、酚基等羥基、巰基、咪唑基、酚基等n優(yōu)

15、點：優(yōu)點：結(jié)合牢固，酶不易脫落結(jié)合牢固，酶不易脫落n缺點：缺點：反應劇烈，酶活回收低（反應劇烈，酶活回收低（30%30%）從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞化學法：共價結(jié)合法化學法：共價結(jié)合法化學法：化學法：交聯(lián)法交聯(lián)法n雙功能雙功能/ /多功能試劑多功能試劑，酶，酶- -酶以共價鍵結(jié)合酶以共價鍵結(jié)合（不需要載體?。ú恍枰d體?。﹏酶酶- -反應基團反應基團 氨基（氨基（N N末端）、末端）、- -氨基、氨基、

16、巰基、酚基、咪唑基巰基、酚基、咪唑基n交聯(lián)劑：交聯(lián)劑：戊二醛戊二醛從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞化學法：交聯(lián)法化學法：交聯(lián)法包埋法：包埋法：網(wǎng)格型網(wǎng)格型n凝膠凝膠，細微網(wǎng)格，細微網(wǎng)格n包埋材料：包埋材料：合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂）合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂）天然高分子（淀粉、明膠、膠原、海藻膠等）天然高分子（淀粉、明膠、膠原、海藻膠等）從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化

17、的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞包埋法：包埋法：微囊型微囊型n半透膜半透膜，顆粒，顆粒n顆粒直徑通常為幾微米到顆粒直徑通常為幾微米到幾百微米，幾百微米， 比網(wǎng)格型要小得多，有利比網(wǎng)格型要小得多，有利于底物與產(chǎn)物的擴散于底物與產(chǎn)物的擴散從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞包埋法包埋法網(wǎng)格型、微囊型網(wǎng)格型、微囊型n優(yōu)點：優(yōu)點：1 1、酶活回收高、酶活回收高 不需要酶蛋白的氨基酸殘基參與反應不需要酶蛋白的氨基酸殘基參與反應2 2、適合于小分子底物和產(chǎn)物、適合于小分子底物和產(chǎn)物n缺點：缺點：酶也易

18、失活酶也易失活 包埋時發(fā)生化學聚合反應包埋時發(fā)生化學聚合反應 但可設計反應條件改善但可設計反應條件改善從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞固定化酶的方法比較固定化酶的方法比較從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)n固定化也是一種化學修飾固定化也是一種化學修飾，酶本身的結(jié)，酶本身的結(jié)構(gòu)必然受到擾動構(gòu)必然受到擾動n酶固定化后，擴散限制效應、空間障礙、酶固定化后，擴散限制效應、空間障礙、載體性質(zhì)造成的分配效應等因素必然對載體性質(zhì)造成

19、的分配效應等因素必然對酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)1 1、酶活力變化：、酶活力變化： 多數(shù)情況下，酶活降低多數(shù)情況下，酶活降低 KmKm增大增大與底物的親和力下降與底物的親和力下降2 2、酶穩(wěn)定性變化、酶穩(wěn)定性變化 熱穩(wěn)定性提高熱穩(wěn)定性提高最適溫度最適溫度 酸堿穩(wěn)定性提高酸堿穩(wěn)定性提高最適最適pHpH 對有機溶劑、酶抑制劑穩(wěn)定性提高對有機溶劑、酶抑制劑穩(wěn)定性提高 貯藏穩(wěn)定性提高貯藏穩(wěn)定性提高從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化

20、酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞n固定化細胞：固定化細胞：受物理、化學等因素，被受物理、化學等因素，被限制自由移動的細胞，保留催化活性，限制自由移動的細胞，保留催化活性，并可反復或連續(xù)使用。并可反復或連續(xù)使用。在固定化酶的基礎在發(fā)展而來在固定化酶的基礎在發(fā)展而來基因工程菌基因工程菌從游離酶到固定化酶從游離酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)固定化細胞固定化細胞S3 S3 酶的化學修飾酶的化學修飾n從從天

21、然酶到修飾酶天然酶到修飾酶n酶的化學修飾的方法酶的化學修飾的方法n化學修飾酶的藥用價值化學修飾酶的藥用價值n化學修飾酶的局限性化學修飾酶的局限性從天然酶到修飾酶從天然酶到修飾酶n工業(yè)用酶穩(wěn)定性問題工業(yè)用酶穩(wěn)定性問題 對熱、酸堿、重金屬、抑制劑、有機溶劑等對熱、酸堿、重金屬、抑制劑、有機溶劑等 使用壽命短，工藝成本高使用壽命短，工藝成本高n 藥用酶：藥用酶： 體內(nèi)半衰期（最適體內(nèi)半衰期（最適pHpH等因素）等因素） 抗原性抗原性改造天然酶的策略改造天然酶的策略1 1、遺傳修飾、遺傳修飾 突變酶突變酶蛋白質(zhì)工程技術(shù)蛋白質(zhì)工程技術(shù)2 2、化學修飾、化學修飾 化學修飾酶化學修飾酶化學修飾試劑化學修飾試

22、劑主要依據(jù)：主要依據(jù)： 1 1、氨基酸殘基側(cè)鏈及修飾劑的反應性、氨基酸殘基側(cè)鏈及修飾劑的反應性 2 2、結(jié)構(gòu)與功能的關系、結(jié)構(gòu)與功能的關系化學修飾的種類化學修飾的種類1 1、酶的表面修飾、酶的表面修飾2 2、酶的分子內(nèi)部修飾、酶的分子內(nèi)部修飾3 3、與輔助因子相關的修飾、與輔助因子相關的修飾1 1）大分子修飾）大分子修飾2 2）小分子修飾）小分子修飾3 3）交聯(lián)修飾）交聯(lián)修飾4 4）固定化修飾）固定化修飾大分子修飾大分子修飾n大分子修飾：大分子修飾：一些可溶性大分子可通過共價一些可溶性大分子可通過共價鍵連接到酶分子表面，形成覆蓋層，對于提高鍵連接到酶分子表面，形成覆蓋層，對于提高藥用酶的穩(wěn)定性

23、、延長體內(nèi)半衰期、降低或消藥用酶的穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期、降低或消除抗原性具有重要意義。除抗原性具有重要意義。對修飾劑的要求：對修飾劑的要求：1 1、具有較大分子量、具有較大分子量2 2、良好的生物相容性和水溶性、良好的生物相容性和水溶性3 3、無毒性、無毒性4 4、無免疫原性、無免疫原性常用大分子修飾劑常用大分子修飾劑1 1、高分子聚合物、高分子聚合物 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、）、 聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA） 、聚丙烯（聚丙烯（PAAPAA）、）、聚賴氨酸聚賴氨酸2 2、天然生物大分子、天然生物大分子 肝素、肝素、人血清白蛋

24、白人血清白蛋白3 3、糖類及衍生物、糖類及衍生物 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、 糖肽、聚乳糖糖肽、聚乳糖常用大分子修飾劑常用大分子修飾劑產(chǎn)品商品名公司首次批準時間適應證human somatropin人生長激素ProtropinSOMAVERT(PEG化化)GenentechNektar/ Pfizer1985.102003.3矮小癥肢端肥大癥rhG-CSF粒細胞集落刺激因子NeupogenNeulasta (PEG化化)AmgenAmgen1991.22002.1白細胞減少interferon -2a干擾素-2aRoferon-APegasys (PEG化化)Roch

25、eRoche/Nektar 1986.62002.10乙肝、丙肝、白血病Kaposis肉瘤等Interferon -2b干擾素-2bIntron APEG-Intron (PEG化化)Schering-PloughSchering-Plough 1986.62001.8乙、丙肝、白血病、Kaposis肉瘤等聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）具有良好的水溶性和生物相容性，具有良好的水溶性和生物相容性，F(xiàn)DAFDA認證：體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性認證：體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性至至20042004年年2 2月，月，F(xiàn)DAFDA批準的生物技術(shù)藥物有批準的生物技術(shù)藥物有4 4個經(jīng)個經(jīng)PEGPE

26、G修飾修飾化學修飾酶的藥用價值化學修飾酶的藥用價值n提高熱穩(wěn)定性提高熱穩(wěn)定性工業(yè)用酶工業(yè)用酶n改善酶學性質(zhì)改善酶學性質(zhì)工業(yè)用酶工業(yè)用酶n改變最適改變最適pHpH值值工業(yè)用酶工業(yè)用酶/ /藥用酶藥用酶 n提高對各類失活因子的抵抗力提高對各類失活因子的抵抗力 工業(yè)用酶工業(yè)用酶/ /藥用酶藥用酶 n消除抗原性消除抗原性藥用酶藥用酶 n延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期藥用酶藥用酶 n改變組織分布能力改變組織分布能力藥用酶藥用酶改變最適改變最適pHpH值值酶酶修飾劑修飾劑天然酶天然酶修飾酶修飾酶豬肝尿酸酶豬肝尿酸酶白蛋白白蛋白10.510.57.4-8.57.4-8.5糜蛋白酶糜蛋白酶肝素肝素8.08.09

27、.09.0吲哚吲哚-3-3-鏈烷鏈烷羥化酶羥化酶聚丙烯酸聚丙烯酸3.53.54.5-5.54.5-5.5豬肝尿酸酶豬肝尿酸酶PEGPEG8.28.29.09.0改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力提高抗失活能力提高抗失活能力n失活因子主要是水解酶和酶抑制劑失活因子主要是水解酶和酶抑制劑過氧化氫酶：過氧化氫酶：PEGPEG修飾，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解修飾，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解的能力明顯提高的能力明顯提高尿激酶：尿激酶：白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盤抑制劑白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解

28、和抗胎盤抑制劑的能力都增加的能力都增加n可能機制：可能機制：修飾劑產(chǎn)生空間屏蔽，有效地阻擋了水解修飾劑產(chǎn)生空間屏蔽，有效地阻擋了水解酶或抑制劑的進攻，或者酶分子中對水解酶或抑制劑酶或抑制劑的進攻，或者酶分子中對水解酶或抑制劑發(fā)敏感基團被修飾而起到了保護作用。發(fā)敏感基團被修飾而起到了保護作用。 改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力消除抗原性消除抗原性酶酶修飾劑修飾劑抗原性抗原性精氨酸酶精氨酸酶PEGPEG消除消除尿酸酶尿酸酶PEGPEG消除消除SODSOD人血清白蛋白人血清白蛋白消除消除 - -葡

29、萄糖苷葡萄糖苷酶酶人血清白蛋白人血清白蛋白消除消除L-L-AsnAsn酶酶PEGPEG消除消除鏈激酶鏈激酶PEGPEG降低降低改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力消除抗原性消除抗原性改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力PFGPFG和人血清白蛋白：和人血清白蛋白：在消除酶的抗原性上效果比較在消除酶的抗原性上效果比較明顯，這是目前比較公認的；明顯，這是目前比較公認的；PVPPVP修飾酶：修飾酶：在重復

30、用于體內(nèi)后，會誘導機體產(chǎn)生抗在重復用于體內(nèi)后，會誘導機體產(chǎn)生抗體而使酶失活；體而使酶失活；糖類物質(zhì)（包括右旋糖苷）：糖類物質(zhì)（包括右旋糖苷）：亦不容易消除酶的抗亦不容易消除酶的抗原性，在體內(nèi)仍可誘發(fā)過敏反應。原性，在體內(nèi)仍可誘發(fā)過敏反應。修飾酶的抗原性與修飾劑有關：修飾酶的抗原性與修飾劑有關：延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期酶酶修飾劑修飾劑天然酶天然酶修飾酶修飾酶精氨酸酶精氨酸酶右旋糖苷右旋糖苷1.4h1.4h12h12h尿酸酶尿酸酶白蛋白白蛋白4h4h20h20hSODSOD白蛋白白蛋白6min6min4h4h腺苷酸脫氫酶腺苷酸脫氫酶PEGPEG30min30min28h28hL-L-AsnAs

31、n酶酶PEGPEG2h2h24h24h改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力改變組織分布能力改變組織分布能力n一些酶經(jīng)化學修飾后，對組織的分布能一些酶經(jīng)化學修飾后，對組織的分布能力就有所改變，能在血液中被靶器官選力就有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收，使更多的酶擇性地吸收，使更多的酶達到靶器官達到靶器官，更好地發(fā)揮藥物的治療效果。更好地發(fā)揮藥物的治療效果。-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：白蛋白修飾，有利于肝細胞攝入白蛋白修飾，有利于肝細胞攝入辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶：聚賴氨酸修飾，細胞的攝入

32、量增聚賴氨酸修飾，細胞的攝入量增加，對細胞的穿透能力能夠增加加，對細胞的穿透能力能夠增加100100倍倍改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋n脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋屬于酶的屬于酶的固定化修飾固定化修飾之一之一1 1、酶的表面修飾、酶的表面修飾2 2、酶的分子內(nèi)部修飾、酶的分子內(nèi)部修飾3 3、與輔助因子相關的修、與輔助因子相關的修飾飾1 1）大分子修飾）大分子修飾2 2）小分子修飾）小分子修飾3 3）交聯(lián)修飾）交聯(lián)修飾4 4）固定化修飾）固定化修飾改變最適改變最適pHpH值值提高

33、抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋n脂質(zhì)體脂質(zhì)體：天然脂類和：天然脂類和/ /或類固醇組成的微或類固醇組成的微球體；酶分子包埋其中后，可通過細胞球體；酶分子包埋其中后，可通過細胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進入細胞內(nèi)的膜融合或內(nèi)吞作用而進入細胞內(nèi) n應用應用：藥用酶（如：藥用酶（如SODSOD、溶菌酶等）溶菌酶等） 半衰期短，免疫原性半衰期短，免疫原性化學修飾化學修飾 不易進入人體細胞不易進入人體細胞脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋改變最適改變最適pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延長體內(nèi)半衰期延長

34、體內(nèi)半衰期改變組織分布能力改變組織分布能力化學修飾酶的局限性化學修飾酶的局限性1 1、某種修飾劑對某一氨基酸側(cè)鏈的化學修飾專某種修飾劑對某一氨基酸側(cè)鏈的化學修飾專一性是相對的一性是相對的2 2、化學修飾酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變、化學修飾酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變在結(jié)構(gòu)與功能研究中不利在結(jié)構(gòu)與功能研究中不利3 3、酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基、酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進行，但非極性側(cè)鏈在維持酶的空間構(gòu)側(cè)鏈上進行，但非極性側(cè)鏈在維持酶的空間構(gòu)象方面也有重要作用象方面也有重要作用S4 S4 酶工程研究的進展酶工程研究的進展n基因工程酶基因工程酶n核酶與脫氧核酶核酶

35、與脫氧核酶n抗體酶抗體酶n人工模擬酶人工模擬酶n有機相酶反應有機相酶反應基因工程酶基因工程酶酶的來源酶的來源n早期酶的生產(chǎn)多以動植物為主要原料（至今仍用）早期酶的生產(chǎn)多以動植物為主要原料（至今仍用） 植物：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等植物：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等 動物：胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、溶菌酶等動物：胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、溶菌酶等生產(chǎn)周期長，受到季節(jié)、氣候等限制生產(chǎn)周期長，受到季節(jié)、氣候等限制n目前工業(yè)上應用的酶大多采用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)目前工業(yè)上應用的酶大多采用微生物發(fā)酵來生產(chǎn) 隨著酶制劑應用范圍的日益擴大，使得單純依賴隨著酶制劑應用范圍的日益擴大，使得單純依賴動植物來源的酶已遠遠不

36、能滿足要求。動植物來源的酶已遠遠不能滿足要求。n基因工程酶：基因工程酶：DNADNA重組技術(shù)，蛋白質(zhì)工程技術(shù)重組技術(shù)，蛋白質(zhì)工程技術(shù)基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶基因工程酶基因工程酶n基因工程酶基因工程酶是酶學和以是酶學和以DNADNA重組技術(shù)為主重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學相結(jié)合的產(chǎn)物。其構(gòu)的現(xiàn)代分子生物學相結(jié)合的產(chǎn)物。其構(gòu)建主要包括三個方面：建主要包括三個方面：基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶1 1、酶基因的克隆和表達、酶基因的克隆和表達利用基因

37、工程菌生產(chǎn)藥用酶利用基因工程菌生產(chǎn)藥用酶2 2、酶基因的遺傳修飾、酶基因的遺傳修飾突變酶突變酶3 3、酶的遺傳設計、酶的遺傳設計合成自然界中沒有的酶合成自然界中沒有的酶蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶錘頭型錘頭型核酶核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶發(fā)夾型發(fā)夾型核酶核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶

38、反應人工模擬酶人工模擬酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶脫氧核酶脫氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗體酶抗體酶n機體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生機體免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生10108 8-10-101010不同的抗體分子，不同的抗體分子，抗體分子多樣性賦予它抗體分子多樣性賦予它幾乎無限

39、的識別能力幾乎無限的識別能力，因，因此將抗體開發(fā)成適合特定用途的酶很有意義此將抗體開發(fā)成適合特定用途的酶很有意義n19691969年，年，JencksJencks根據(jù)根據(jù)PaulingPauling的化學反應過渡態(tài)的化學反應過渡態(tài)理論預言，如果找到理論預言，如果找到針對某個反應過渡態(tài)的抗體針對某個反應過渡態(tài)的抗體，將其加入到該反應體系中，就可觀察到這個抗體將其加入到該反應體系中，就可觀察到這個抗體對相應化學反應的催化效應對相應化學反應的催化效應基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗體酶抗體酶n19751975年，年，單克隆抗體

40、單克隆抗體制備技術(shù)的出現(xiàn)為抗體酶制制備技術(shù)的出現(xiàn)為抗體酶制備技術(shù)的開發(fā)鋪平了道路備技術(shù)的開發(fā)鋪平了道路n19861986年，美國加州年，美國加州LernerLerner和和SchultzSchultz領導的研究小領導的研究小組同時報道了成功制備出具有催化能力的單克隆組同時報道了成功制備出具有催化能力的單克隆抗體抗體催化抗體（催化抗體（catalytic antibodycatalytic antibody），也也叫叫抗體酶（抗體酶（abzymeabzyme）n迄今已成功地開發(fā)出天然酶所催化的迄今已成功地開發(fā)出天然酶所催化的6 6大類酶促反大類酶促反應和數(shù)十種類型的常規(guī)反應的抗體酶應和數(shù)十種類型

41、的常規(guī)反應的抗體酶基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗體酶抗體酶n抗體酶具有雙重功能：抗體酶具有雙重功能：識別抗原靶目標及特識別抗原靶目標及特定的催化功能定的催化功能，在醫(yī)療上有著廣泛的應用：，在醫(yī)療上有著廣泛的應用：1 1、設計抗體酶殺死特殊的病原體、設計抗體酶殺死特殊的病原體2 2、抗體酶活化處于靶部位的藥物前體，抗體酶活化處于靶部位的藥物前體，以降低藥物毒性，增加其在體內(nèi)的穩(wěn)定性以降低藥物毒性，增加其在體內(nèi)的穩(wěn)定性基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗

42、體酶抗體酶例例1 1：LandryLandry等獲得可催化可卡因降解的單等獲得可催化可卡因降解的單克隆抗體，可用于戒毒，阻斷可卡因上癮克隆抗體，可用于戒毒，阻斷可卡因上癮基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗體酶抗體酶例例2 2：抗癌藥物：抗癌藥物5FdU5FdU（5-5-氟脫氧尿嘧啶氟脫氧尿嘧啶 ）不但抑制腫瘤細胞的不但抑制腫瘤細胞的DNADNA合成，也抑制正合成，也抑制正常細胞的常細胞的DNADNA合成，毒性很大，然而合成，毒性很大，然而5FdU5FdU的前體化合物卻是無毒的。的前體化合物卻是無毒的。當當5FdU5FdU的

43、前體化合物遇到識別腫瘤細胞的的前體化合物遇到識別腫瘤細胞的抗體酶抗體酶，才會釋放出有毒的，才會釋放出有毒的5FdU5FdU，殺死該殺死該部位的腫瘤細胞。部位的腫瘤細胞?；蚬こ堂富蚬こ堂负嗣概c脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶抗體酶抗體酶5FdU5FdU前體前體5FdU5FdU基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶有機相酶反應有機相酶反應基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶有機相酶反應有機相酶反應可以用來制備手性藥物

44、可以用來制備手性藥物n手性化合物，光學活性化合物手性化合物，光學活性化合物 具有旋光性質(zhì)具有旋光性質(zhì)n生物體內(nèi)的手性環(huán)境生物體內(nèi)的手性環(huán)境 氨基酸、蛋白質(zhì)：氨基酸、蛋白質(zhì)： L-L- 多糖、核酸中的糖類：多糖、核酸中的糖類：D-D-n手性藥物：手性藥物：進入人體后，藥理和生理作用與體內(nèi)進入人體后，藥理和生理作用與體內(nèi)靶分子之間的手性匹配和分子識別能力有關。靶分子之間的手性匹配和分子識別能力有關?；蚬こ堂富蚬こ堂负嗣概c脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶有機相酶反應有機相酶反應60%40%10%90%基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗

45、體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶有機相酶反應有機相酶反應基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶有機相酶反應有機相酶反應n許多手性藥物的對映體具不同的藥理作用許多手性藥物的對映體具不同的藥理作用n19921992年，年，F(xiàn)DAFDA明確提出對手性藥物的要求明確提出對手性藥物的要求n單一對映體手性藥物研究單一對映體手性藥物研究 新藥中單一對映體占絕大多數(shù)新藥中單一對映體占絕大多數(shù) II/IIIII/III臨床臨床80%80%為手性藥物為手性藥物基因工程酶基因工程酶核酶與脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶

46、反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶人工模擬酶人工模擬酶n對熱敏感、穩(wěn)定性差和來源有限等缺點對熱敏感、穩(wěn)定性差和來源有限等缺點限制了酶的應用，限制了酶的應用，1980S1980S以來，研究和開以來，研究和開發(fā)新催化劑發(fā)新催化劑人工模擬酶人工模擬酶n人工模擬酶（人工模擬酶（enzymes of artificial enzymes of artificial imitationimitation），簡稱簡稱人工酶人工酶或或模擬酶模擬酶，就，就是根據(jù)酶的作用機理，用人工方法合成是根據(jù)酶的作用機理，用人工方法合成的具有的具有催化活性催化活性（底物結(jié)合部位和催化（底物結(jié)合部位和催化中心）中心）的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物。的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物?；蚬こ堂富蚬こ堂负嗣概c脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶有機相酶反應有機相酶反應人工模擬酶人工模擬酶人工模擬酶人工模擬酶成功的例子：成功的例子：絲氨酸蛋白水解酶絲氨酸蛋白水解酶已可以用小分子化合物已可以用小分子化合物來模擬；來模擬；在合成的聚乙烯亞胺上引入十二烷基和在合成的聚乙烯亞胺上引入十二烷基和咪唑基，所形成的咪唑基，所形成的芳香硫酸酯酶芳香硫酸酯酶比天然比天然酶活力高酶活力高100100倍。倍?；蚬こ堂富蚬こ堂负嗣概c脫氧核酶核酶與脫氧核酶抗體酶抗體酶