離子交換層析分離純化蔗糖酶

1、即實驗報告專業(yè)：姓名：學號：日期：地點：成績：實驗內容和原理（必填）四、實驗器材與儀器（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得課程名稱：生物化學實驗（甲）指導老師:裝 同組學生姓名：訂一、實驗目的和要求（必填）二:三、實驗材料與試劑（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填）:七、實驗結果與分析（必填）i離子交換柱層析分離純化蔗糖酶一、實驗目的和要求：1、學習離子交換層析的基本原理；2、學習離子交換層析分離蛋白質的基本方法和技術;3、學習蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法。實驗內容和原理:1、離子交換層析（ 簡稱為）離子交換層析是常用的層析方法之一。它是以離子交換劑為固定相，根 據(jù)流動相中的組分離子

2、與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小 的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換劑與流動相中離子或離子化合 物的反應主要以離子交換方式進行，或者借助離子交換劑上電荷基團對溶液 中離子或離子化合物的吸附作用進行。這些過程都是可逆的。在某一值的溶 液中，不同的蛋白質所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有 區(qū)別。當洗脫液的改變或者鹽的離子強度逐漸提高時，使某一種蛋白質的電 荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質按所帶電荷的強弱逐 一被洗脫下來，達到分離的目的。離子交換劑是由基質、電荷基團（或功能基團）和反離子構成。溶 基質電荷基團反離子液 中 陽離子交換劑基質一+可逆交換

3、L陰離子交換劑基質可逆交換+尊電點蛋 白 ee.I l吸附陰離子交換剤 ilr r)H電123 45、678910何*吸附陽離子交換劑pH<pJ (+) pH =(0) pH> (-)由于蔗糖酶的偏酸性，所以在7.3緩沖液環(huán)境中，粗分離純化樣品蔗糖酶帶負電荷，因此我們用陰離子交換劑可以先與蔗糖酶樣品可逆交換吸附，然 后通過用鹽離子強度逐漸提高的洗脫液，使蔗糖酶和其他雜蛋白質的電荷被 中和，與離子交換劑的親和力降低，把不同的蛋白質按所帶電荷的強弱逐一 被洗脫下來，從而達到分離蔗糖酶的目的。2、酶活力檢測（定性檢測）蔗糖酶（B咲喃型果糖苷-果糖水解酶3.2.1.26 ），是一種水解酶。

4、它能 催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2 -糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖 和果糖（還原糖）。因此，每水解 1蔗糖，就能生成2還原糖。還原糖的測 定有多種方法，如米用3.5 二硝基水楊酸法，其原理是3.5 二硝基水楊酸 與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量和反 應液的顏色深度成正比。本實驗在離子交換層析分離純化的過程中， 對分離純化樣品采用3.5 -二 硝基水楊酸法來初步判定樣品中還原糖含量的多少，由此來確定并收集蔗糖 酶純化樣品。三、實驗材料與試劑：1、實驗材料蔗糖酶粗分離純化樣品皿2、實驗試劑（弱堿性陰離子交換劑）;207.3緩沖液；20 ,（1 ）7.3緩沖

5、液（學生自配）；0.2乙酸緩沖液，4.5 ;5%蔗糖溶液;3 , 5-二硝基水楊酸試劑甲液：溶解6.9g結晶酚于15.2 10 %溶液中，并用水稀釋至69,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到30010溶液中，再加入800 1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲，乙二溶液相混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用，在室溫放置7-10天 以后使用。四、實驗器材與儀器：1、高速冷凍離心機；2、層析柱（© 1.0 X 20 cm ） （1 支/ 組）；3、恒流泵（流速0.81） （10） （1臺/組）；4、梯度混合器（100梯度杯）（1套/組）；5、核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.

6、5A ）（1臺/組）；6、記錄儀（紙速：0.5 ;靈敏度：50 ）（ 1臺/組）；7、部分收集器及收集試管（4管）（1臺/組）；8、 鐵架臺、夾子（固定層析柱用）（1套/組）；9、一 20 C冰箱（保存樣品用）；10、微量移液槍 200、1000 ；11、1.5離心管（留樣品皿和樣品W用）；12、 7離心管（留樣品W用）；13、恒溫水?。?00 °C）；14、試管、移液管、試管架等。五、操作方法和實驗步驟:1、離子交換劑準備：（實驗室已準備好）,取適量一，加入0.5溶液，輕輕攪拌，浸泡0.5小時，用玻璃 砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50 0.5 攪勻，

7、浸泡0.5小時，同上，用去離子水洗至近中性，（，用后務必回收） 浸入207.3緩沖液中平衡備用。2、樣品處理：將乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白樣品充分溶解于15 20 7.3緩沖液；4 C15000,離心10分鐘，收集樣品上清液（樣品皿）測量總體積（數(shù)），留取1 （樣品皿）用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力的測定以及用于分析；將其余樣品（樣品皿）作離子交換柱層析進一步分離純化蔗糖酶（可先取50酶液做酶活力檢測）。3、純化檢測儀器連接：將梯度混合器（100梯度杯）,層析柱（©1.0 x 20 cm ）,恒流泵（10）（流 速0.81）,核酸蛋白檢測儀（靈敏度0.5A ），記錄儀（紙速：0.5,

8、50 ）、 部分收集器（45管/5 ）等按下圖連接并設置好。純化檢測儀器連接示意圖:1、50 20, 7.3 緩沖液2、50 20,( 1 )7.3 緩沖液4、裝柱（層析柱規(guī)格1 X 20）、平衡：裝柱前先調好流速0.81 ,然后將柱下端的出水口關閉，加進5 （約1/3 柱床體積）20 、7.3的緩沖液，然后將處理好的一，輕輕攪勻（注意不能太稀，也不能太稠，剛好呈流質狀態(tài)）沿玻棒靠近柱管壁慢慢連續(xù)加進 柱內至層析柱上端。注意不能帶進氣泡，待凝膠自然沉積離柱管上端約1-2后松開層析柱出口，控制流速0.81 ;待柱內一凝膠沉降至穩(wěn)定高度并分出水層后，吸去水層，用玻棒將沉降界面攪勻，再補加處理好的一

9、凝膠,直到凝膠沉降至穩(wěn)定高度距層析柱上端約 3處為止（這時須保持一凝膠柱 面平整）。用20、7.3的緩沖液連通層析柱，進行柱平衡，直到流出液與緩沖液的一致。5、加樣：停止加入207.3緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時，恒流泵停止工作。用膠頭滴管緩慢將蔗糖酶蛋白樣品溶液（樣品皿）加入層析柱中，注意順著柱壁滴加，盡可能保持膠面平整。打開恒流泵，使樣品溶液進入膠 體，待樣品溶液完全進入膠體后，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端 的樣品洗下，并完全進入膠體后，再加洗脫緩沖液至一定高度。6、洗脫：方法1梯度洗脫法：加樣后，用207.3緩沖液進行平衡，洗脫流速為0.8 1，洗去未被 一凝膠吸附的雜蛋

10、白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測儀上繪出的基線穩(wěn)定， 用20 7.3緩沖液梯度洗脫（濃度為0-1 ），層析柱聯(lián)上梯度混合器，混 合器中分別為50 0.057.3緩沖液和50含1的0.057.3緩沖液。洗脫流速為0.81 ,每4接一管，洗脫至緩沖溶液流完為止。跟蹤測定各管的蔗 糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中， 測量總體積（數(shù)）（樣品W）, 并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力測定、分析、酶的基本性質實 驗和用于“用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響”（半自主性設計實 驗），樣品20 C低溫保存?zhèn)溆?。方?、一步洗脫法：上樣后，用20 7.3緩沖液進行平衡，洗脫流速為0.81，洗去

11、 未 吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測儀上繪出的基線穩(wěn)定。 用0.15 20 7.3緩沖液繼續(xù)洗脫被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脫流速為0.81 ,4管/5 , 直至待層析柱流出液在核酸蛋白檢測儀上繪出的基線穩(wěn)定。測定各接收管的蔗糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出總體積（數(shù)）（樣品IV），并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測定、 蔗糖酶活力測定和分析以及用于 “用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響”（半自主性設計實驗），樣品-20 C低溫保存?zhèn)溆谩?、蔗糖酶活力檢測空白對照樣品管0.2乙酸緩沖液，4.50.50.55%蔗糖溶液0.50.5蒸餾水1.00.9分離純化樣品溶液/0.150 C水浴10分鐘3,5-二硝基水楊酸1.01.0100 C水浴5分鐘蒸餾水55觀察顏色收集活力高的蔗糖酶液，測量總體積（數(shù)）（樣品V） , -20 C保存?zhèn)溆? 用于蔗糖酶蛋白含量測定、蔗糖酶活力測定和分析以及用于用正交法測定幾 種因素對蔗糖酶活性的影響（限定性設計實驗）。六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理:七、實驗結果與分析：八、討論、心得：1. 本實驗所用的弱堿性陰離子交換劑（）價格昂貴，實驗過程中要注意，不要外撒，不要浪費。2. 在連接純化檢測儀器時要注意先后順序，制作層析柱時柱下端的旋鈕一定 要有膜覆蓋，否則在分離純化的過程中交換劑也會流下來。3. 在裝柱前要先把一攪拌均勻，裝柱時要避免一露出緩