生化物質(zhì)的制備

1、提取與沉淀分離技術(shù)提取與沉淀分離技術(shù)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生化分析與實(shí)驗(yàn)生化分析與實(shí)驗(yàn) 生化物質(zhì)（生命大分子物質(zhì)）生化物質(zhì)（生命大分子物質(zhì)）通常是指通常是指動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育、新陳動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝時(shí)，所形成的蛋白質(zhì)（包括酶）和核酸代謝時(shí)，所形成的蛋白質(zhì)（包括酶）和核酸等有機(jī)化合物的總稱。等有機(jī)化合物的總稱。 生化物質(zhì)的提取與沉淀分離技術(shù)生化物質(zhì)的提取與沉淀分離技術(shù) 生化物質(zhì)的特點(diǎn)：生化物質(zhì)的特點(diǎn)：1、生化物質(zhì)、生化物質(zhì)組成非常復(fù)雜組成非常復(fù)雜。其中包括數(shù)百種甚至。其中包括數(shù)百種甚至數(shù)千種化合物，并且在分離過程中，這些化合物數(shù)千種化合物，并且

2、在分離過程中，這些化合物仍仍在發(fā)生代謝變化在發(fā)生代謝變化，如，如 蛋白質(zhì)和核酸的水解。蛋白質(zhì)和核酸的水解。2、有些化合物的、有些化合物的含量極微含量極微，如激素等。，如激素等。3、許多具有、許多具有生物活性生物活性的物質(zhì)一旦離開活體，很易的物質(zhì)一旦離開活體，很易變性破壞，因此常選用比較溫和的條件進(jìn)行制備。變性破壞，因此常選用比較溫和的條件進(jìn)行制備。第一節(jié)第一節(jié) 生物材料的選擇生物材料的選擇n（一）選擇生物材料的原則：（一）選擇生物材料的原則： 有效成分含量多，穩(wěn)定性好； 來源豐富，保持新鮮； 提取方法簡(jiǎn)單； 有綜合利用價(jià)值等。n（二）生物材料一般可以分為兩大類：（二）生物材料一般可以分為兩大類

3、： 天然生物材料 人工生物材料n天然生物材料天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量較高的生物個(gè)體、器官或組織。n人工生物材料人工生物材料又分為三種： 1、新品種材料 2、組織培養(yǎng)材料 3、生物產(chǎn)品與生物制品材料n（三）蛋白質(zhì)原料的選擇（三）蛋白質(zhì)原料的選擇 如何提高制備如何提高制備天然蛋白質(zhì)的品質(zhì)、天然蛋白質(zhì)的品質(zhì)、產(chǎn)量和降低成本？產(chǎn)量和降低成本？種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌宿主菌或細(xì)胞細(xì)胞1 1種屬種屬 豬胰臟中 單位含量3000 IUkg牛胰臟中 單位含量4000 IUkg 抗原性方面豬胰島素比牛胰島素低，

4、前者與抗原性方面豬胰島素比牛胰島素低，前者與人胰島素相比，只有人胰島素相比，只有1 1個(gè)個(gè)氨基酸的差異，而氨基酸的差異，而牛有牛有3 3個(gè)個(gè)氨基酸的差異。氨基酸的差異。胰島素（胰島素（isulin)isulin) PKPK2 2發(fā)育階段發(fā)育階段 幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動(dòng)物。動(dòng)物。 胸腺（胸腺（thyumsthyums）胸腺素調(diào)節(jié)免疫功能）胸腺素調(diào)節(jié)免疫功能3 3生物狀態(tài)生物狀態(tài) 動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中的胰島動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對(duì)提取胰島素有利，但素含量增加，對(duì)提取胰島素

5、有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對(duì)膽膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對(duì)膽汁的收集不利。汁的收集不利。 4 4原料來源原料來源 血管舒緩素血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。因其不含蛋白水解酶。 5 5原料解剖學(xué)部位原料解剖學(xué)部位 豬胰臟中，胰尾部分含豬胰臟中，胰尾部分含激素激素較多，較多，而胰頭部分含而胰頭部分含消化酶消化酶較多。如分別摘取較多。如分別摘取則可提高各產(chǎn)品的收率。則可提高各產(chǎn)品的收率。 胃膜素胃膜素以采取全胃粘膜為好，以采取

6、全胃粘膜為好，胃蛋白胃蛋白酶酶(pepsin)(pepsin)則以采取胃底部粘膜為好，則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化酶。因胃底部粘膜富含消化酶。 6.6.從簡(jiǎn)化提純步驟著手從簡(jiǎn)化提純步驟著手 如從鴿肝中提取如從鴿肝中提取乙?；敢阴；?，需，需將動(dòng)物饑餓后取材，可減少肝糖將動(dòng)物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡(jiǎn)化純化步驟。原，以簡(jiǎn)化純化步驟。7 7對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求 選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)胞也應(yīng)考慮到后處理的問題。胞也應(yīng)考慮到后處理的問題。 大腸桿菌大腸桿菌表達(dá)；（分泌，毒素）表達(dá)；（分泌，毒素）

7、 枯草桿菌枯草桿菌或或酵母菌酵母菌表達(dá)；（糖基化）表達(dá)；（糖基化） 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞和和昆蟲細(xì)胞昆蟲細(xì)胞表達(dá)表達(dá)第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞及組織的破碎細(xì)胞及組織的破碎 細(xì)胞及組織破碎的方法多種多樣，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞及組織破碎的方法多種多樣，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒牧系牟煌梢圆捎貌煌募?xì)胞破碎方法：和材料的不同可以采用不同的細(xì)胞破碎方法：（一）機(jī)械破碎方法：（一）機(jī)械破碎方法： 主要通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的作用，使組主要通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的作用，使組織或細(xì)胞破碎的方法織或細(xì)胞破碎的方法。 搗碎法、研磨法、勻漿法搗碎法、研磨法、勻漿法（二）物理破碎方法（二）物理破碎方法1.1.溫度差破碎法（反復(fù)凍融

8、法）溫度差破碎法（反復(fù)凍融法） 把待破碎的樣品把待破碎的樣品迅速冷迅速冷至至15152020，使之凝固，然后使之凝固，然后緩慢地溶解緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，如此反復(fù)操作，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可以破碎。大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。也采用先高溫然后突然冷凍的方法。也采用先高溫然后突然冷凍的方法。通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。使組織細(xì)胞破碎的方法。 2. 2. 壓力差破碎法壓力差破碎法高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法 加氣壓或水壓達(dá)加氣壓或水壓達(dá)20.5920.5934.32MPa34.32MPa的壓

9、力時(shí)，的壓力時(shí)，可使可使90%90%以上細(xì)胞被壓碎。以上細(xì)胞被壓碎。（1.013105 Pa10.336m水柱）3 3超聲波處理法超聲波處理法 多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對(duì)超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。（三）化學(xué)破碎法（三）化學(xué)破碎法有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑：可以使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性。表面活性劑：表面活性劑：表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。 較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉、特立頓（Triton）、吐溫（Tween）等。1. 1.

10、自溶法自溶法 即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。 自溶的溫度，動(dòng)物材料選在04，微生物材料則多在室溫下進(jìn)行。（四）酶促破碎法（四）酶促破碎法 通過細(xì)胞本身的酶系本身的酶系或外加酶制劑外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞。2 2酶處理法酶處理法 用外來酶處理生物材料： 溶菌酶溶菌酶是專一地破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的酶； - -葡聚糖酶葡聚糖酶用于酵母細(xì)胞的破碎； 用于專一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶糖酶等。第三節(jié)第三節(jié) 生物分子的提取生物分子的提

11、取提?。禾崛。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ芤海┦侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ芤海┨幚碓希褂蛛x物質(zhì)充分溶解到溶劑（溶液）處理原料，使欲分離物質(zhì)充分溶解到溶劑（溶液）中的過程，也稱為中的過程，也稱為抽提。抽提。提取液應(yīng)具備的條件提取液應(yīng)具備的條件：對(duì)有效成分溶解度大，破對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用??；對(duì)雜質(zhì)溶解度小或不溶解；來源廣泛、壞作用??；對(duì)雜質(zhì)溶解度小或不溶解；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等價(jià)格低廉、操作安全等。 生物分子可以分為：生物分子可以分為： 生物大分子生物大分子和和生物小分子生物小分子 生物小分子生物小分子的結(jié)構(gòu)由較強(qiáng)的共價(jià)鍵決定； 生物大分子生物大分子中除共價(jià)

12、鍵外，還含有較弱的共價(jià)鍵和次級(jí)鍵，故需溫和的條件才能保證生物大分子的活性不被破壞。（一）提取方法（一）提取方法1. 鹽溶液提?。蝴}溶液提?。蝴}溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象與與鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象2. 酸溶液提取酸溶液提取3. 堿溶液提取堿溶液提取4.有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取 分子在其等電點(diǎn)時(shí)，容易互相吸引，聚合成分子在其等電點(diǎn)時(shí)，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分子離散，溶入水中。子離散，溶入水中。（二）影響提取的因素（二）影響提取的因素1. 1. 溶解度（溶劑的性質(zhì)）：溶解度（溶劑的性質(zhì)）：根據(jù)相似相溶原理2. 2. 擴(kuò)散速度：擴(kuò)散速度：與溫度、黏

13、度、擴(kuò)散面積、擴(kuò)散距離、濃度差有關(guān)。3. 3. 溫度：溫度：注意蛋白、核酸等分子的變性失活。4.4. PHPH值：值：等電點(diǎn)等電點(diǎn)（pI） 兩性電解質(zhì)5. 5. 提取液的體積：提取液的體積：提取液為原料液的3-5倍，多次提取第四節(jié)：第四節(jié)：生物分子的濃縮生物分子的濃縮（沉淀分離）（沉淀分離）n1 1、沉淀法、沉淀法: :是通過改變某些條件或添加某種物是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使某溶質(zhì)在溶液中的溶解度降低，從溶液中質(zhì)，使某溶質(zhì)在溶液中的溶解度降低，從溶液中沉淀析出，再經(jīng)過離心或過濾收集沉淀物。沉淀析出，再經(jīng)過離心或過濾收集沉淀物。n A.A.鹽析法；鹽析法； 硫酸銨硫酸銨 鹽析注意事項(xiàng)鹽

14、析注意事項(xiàng)n B.B.等電點(diǎn)沉淀法；等電點(diǎn)沉淀法；pI（isoelectric point） n C.C.有機(jī)溶劑沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法；乙醇，異丙醇乙醇，異丙醇n D.D.復(fù)合沉淀法；復(fù)合沉淀法； PEGPEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）n E.E.金屬鹽沉淀法；金屬鹽沉淀法；n F. F. 選擇性變性沉淀法。選擇性變性沉淀法。 蛋白質(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域都聚集許多水分子，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域都聚集許多水分子，當(dāng)大量鹽類加入時(shí)這些水分子被抽出，以便與鹽離子進(jìn)大量鹽類加入時(shí)這些水分子被抽出，以便與鹽離子進(jìn)行水合，暴露出來的疏水性區(qū)域相互結(jié)合形成沉淀。行水合，暴露出來的疏水性區(qū)域相互結(jié)合形成

15、沉淀。n2 2、吸附法：、吸附法：將干葡聚糖凝膠加入提取液中，由于凝膠吸水，提取液的體積可縮小三倍左右。n 3、超過濾法：、超過濾法：把提取液裝入過濾裝置，在空氣或氮?dú)獾膲毫ο?，使小分子物質(zhì)通過半透膜，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。4. 4. 透析濃縮法透析濃縮法n1 1、原理：、原理：n 天然或人工半透膜只允許小分子通過而阻礙大分子通過。當(dāng)膜的兩側(cè)存在小分子濃度梯度差時(shí)，小分子就從高濃度一側(cè)向低濃度一側(cè)擴(kuò)散，直至達(dá)到平衡，如果能不斷去除擴(kuò)散出來的小分子，從而達(dá)到分離純化的目的。n影響透析的因素影響透析的因素 1 1、半透膜的通透性：、半透膜的通透性：半透膜的通透性取決于膜孔徑的大小，在能阻礙大分子擴(kuò)散

16、的前提下，孔徑越大，透析速度越快。 2 2、透析外液的更換、透析外液的更換 3 3、溫度：、溫度：溫度越高，透析速度越快。 4 4、壓力：、壓力：用跨膜的壓力梯度可加速大分子的分離速度。n5 5、減壓蒸餾濃縮法：、減壓蒸餾濃縮法：將提取液裝入減壓蒸餾裝置中，在減壓真空狀態(tài)下進(jìn)行蒸餾。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀6 6、冰凍干燥法、冰凍干燥法濃縮實(shí)例濃縮實(shí)例（一）、硫酸氨鹽析法（一）、硫酸氨鹽析法1.1.原理：原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會(huì)隨著根據(jù)蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又逐漸下降，增高到

17、一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出，鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增直至蛋白質(zhì)析出，鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐水化膜逐漸被破壞漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子之間相互聚，最終引起蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。集并從溶液中析出。2 2、影響蛋白質(zhì)鹽析的因素、影響蛋白質(zhì)鹽析的因素（）蛋白質(zhì)濃度對(duì)鹽析的影響：（）蛋白質(zhì)濃度對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)濃度過大，鹽析時(shí)發(fā)生共沉現(xiàn)象，分離效果不好；蛋白質(zhì)濃度太稀，耗鹽量過大，蛋白質(zhì)回收率也低。一般為2.5%-3.0%的蛋

18、白質(zhì)濃度較適中。（）離子強(qiáng)度和離子類型對(duì)鹽析的影響：（）離子強(qiáng)度和離子類型對(duì)鹽析的影響：離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低，越容易產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象；離子半徑小而價(jià)數(shù)高的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而價(jià)數(shù)低的離子對(duì)鹽析影響弱。（）對(duì)鹽析的影響：（）對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，溶解度越大；在凈電荷為零時(shí)，溶解度最低。一般將值調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，這樣有利于鹽析。（二）、有機(jī)溶劑沉淀法（二）、有機(jī)溶劑沉淀法n1 1、原理：、原理：n 有機(jī)溶劑對(duì)許多溶于水的小分子生化物質(zhì)以有機(jī)溶劑對(duì)許多溶于水的小分子生化物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子都能發(fā)生沉及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子都能發(fā)生沉淀作用。淀作用。n 對(duì)于具有表面水層的生物大