第3章_微生物細胞的破碎技術

1、 1.1目的物位置目的物位置胞外產(chǎn)品：胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代謝物各種胞外酶、胞外多糖、細胞代謝物細胞本身：細胞本身：單細胞蛋白（單細胞蛋白（SCP）胞內(nèi)產(chǎn)品胞內(nèi)產(chǎn)品: 胞內(nèi)酶，基因工程產(chǎn)物等胞內(nèi)酶，基因工程產(chǎn)物等1.2 1.2 細胞的破碎定義細胞的破碎定義 用物理、化學、酶或機械的方法破壞細胞壁或細胞膜。用物理、化學、酶或機械的方法破壞細胞壁或細胞膜。1.3 1.3 細胞壁特點細胞壁特點a.a.保護細胞保護細胞 b.b.調(diào)節(jié)、控制代謝調(diào)節(jié)、控制代謝 c.c.抗機械撞擊抗機械撞擊第第3章章 微生物細胞的破碎微生物細胞的破碎1. 微生物細胞的破碎技術概述微生物細胞的破碎技術概述2

2、細胞壁的組成和結構細胞壁的組成和結構 1.細胞壁的組成和破碎阻力細胞壁的組成和破碎阻力2.細胞壁的結構細胞壁的結構 2.1 細胞壁的組成和破碎阻力細胞壁的組成和破碎阻力2.1.1細菌細菌：肽聚糖，蛋白質(zhì)，磷壁酸，糖，脂；主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構。2.1.2酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，脂；主要阻力來自于壁結構交聯(lián)的緊密程度和厚度。2.1.3絲狀真菌：絲狀真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結構。back2.2 細胞壁的結構細胞壁的結構細菌的細胞壁細菌的細胞壁酵母菌的細胞壁酵母菌的細胞壁絲狀真菌的細胞壁絲狀真菌的細胞壁backnextbac

3、k2.2.1細菌細胞壁的組成細菌細胞壁的組成a：肽聚糖b：氨基酸：D-丙氨酸， D-谷氨酸，L-丙氨酸， L-賴氨酸c：磷壁質(zhì)：糖醛磷酸酯的聚合物革蘭氏陽性菌d：糖e：脂質(zhì)革蘭氏陰性菌2.2.2 革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌a.1550層肽聚糖片層b.壁磷壁酸和膜磷壁酸2.2.3革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 a.12層肽聚糖片層b.脂蛋白（將外膜固定于肽聚糖層）、脂質(zhì)雙層及脂多糖（穩(wěn)定細胞結構）back酵母菌的細胞壁酵母菌的細胞壁back絲狀真菌的細胞壁絲狀真菌的細胞壁各種微生物細胞壁的結構與組成各種微生物細胞壁的結構與組成 3 微生物細胞的破碎技術微生物細胞的破碎技術 3.1細胞破碎機理圖細胞破碎機

4、理圖3.1.1高壓勻漿法高壓勻漿法高壓勻漿器原理利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細胞破裂,從低壓環(huán)境釋放出來。構造：高壓位移泵、針形閥影響因素：a. Tb.操作壓力高壓勻漿器高壓勻漿器3.1.2 珠磨法珠磨法v原理：在膜腔中裝入小玻璃球或小鋼球，在攪拌漿的作用下，它將使細胞懸浮液與細胞懸浮液，細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起發(fā)生碰撞、剪切，使細胞在某種程度上破碎，再由液珠分離器分開、排出。（這些裝置的主要缺點是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。）v構件：微珠、冷卻裝置、攪拌漿、液珠分離器、物料進出口。見圖高速珠磨機高速

5、珠磨機影響因素：攪拌速度 適中細胞濃度最佳珠粒的大小、用量T5-40流量小(6)微生物特性3.1.3超聲波法原理：細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。適用：對于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌細胞容易破碎，對酵母菌的效果級差。特點：該法不適于大規(guī)模操作，因為放大后，要輸入很高的能量來提供必要的冷卻，這是困難的。 電聲超聲波發(fā)生器電聲超聲波發(fā)生器影響因素：a.振幅聲能b.粘度小c.表面張力小d.用量e.球珠大小f.

6、探頭材料、形狀鈦，小g.流速 3.2.1 化學法定義：化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分的方法。常用：a.酸堿：可以使蛋白質(zhì)水解或蛋白質(zhì)電荷改變b.脂溶性有機溶劑如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等溶解細胞壁脂質(zhì)層從而使細胞溶解或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來（但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學物質(zhì)的問題。） c.表面活性劑兩性基團（親水基團、疏水基團） 3.2.2 酶解法定義：利用酶反應，分解破壞細胞壁上特殊的鍵使細胞壁通途性發(fā)生改變，從而達到破壁的目的。優(yōu)點：專一性強，條件溫和，破壞少，收率高，無細胞碎片。缺點：酶水解費用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實驗室研究。常用酶： a.溶

7、菌酶，它能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。b.細菌：糖苷酶，多肽酶，N-乙酰胞壁酰胺-L-丙氨酸酰胺酶C. 真菌、酵母：葡聚糖酶，甘露糖酶，甲克素酶，蛋白酶d.藻類：纖維素酶注意事項a.適應酶以及酶反應體系b.特定的反應條件：T、pH、濃度等c.與其他方法結合起來Eg:輻射、高濃度鹽、加EDTA及生長因子等3.2.3 滲透壓沖擊滲透：高低原理：將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液，細胞失水)，待達到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞壁的破

8、裂。適用：滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。 3.2.4凍結-融化法定義：將細胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復多次而達到破壁作用。原理：疏水鍵破壞；水結成冰體積增大。適用：對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。3.2.5干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等?？諝飧稍镏饕m用于酵母菌。真空干燥適用于細菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。細胞破碎主要方法細胞破碎主

9、要方法 機械破碎法與非機械法比較機械破碎法與非機械法比較 3.3 破碎方法的選擇破碎方法的選擇細胞的數(shù)量破碎條件目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性破碎目標待破碎細胞的機械強度3.3.1破碎方法選擇原則破碎方法選擇原則(1) (1) 目標生化物質(zhì)的位置：目標生化物質(zhì)的位置：(2) (2) 目標生化物質(zhì)對破碎條件的敏感性：目標生化物質(zhì)對破碎條件的敏感性： (3) 破碎程度、目的破碎程度、目的 (4) 規(guī)模、經(jīng)濟規(guī)模、經(jīng)濟3.4破碎率的測定破碎率的測定 1.直接測定法平板計數(shù)直接測定法平板計數(shù)2.間接法測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力或間接法測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力或相對電導率相對電導率4. 4. 基因工程

10、表達產(chǎn)物的后處理基因工程表達產(chǎn)物的后處理 包含體的分離與復性包含體的分離與復性 4.1什么是包含體 外源蛋白質(zhì)基因在受體菌中表達時形成的不溶的沒有活性的蛋白質(zhì)聚集體稱為包含體。（包含體內(nèi)除目標蛋白外還有微量的質(zhì)粒，rRNA和RNA聚合酶。） 4.2包含體形成的原因 蛋白質(zhì)的多肽鏈折疊成立體結構的過程中受周圍環(huán)境的影響，分子間的相互作用影響到分子內(nèi)的折疊。a.由于表達的外源蛋白缺少某些折疊的協(xié)助因子或局部微環(huán)境不適宜，不能正確的形成次級鍵。b.表達率過高，合成速度太快，無足夠的時間折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白質(zhì)間非特異性結合，導致溶解度降低。 c.重組蛋白氨基酸組成硫氨基酸越多越易形成包含體。 d.重組蛋白質(zhì)是E.coli異源蛋白，大量生成后，缺乏修飾所需要的酶和輔助因子，致使中間體大量累積，異形成包含體。E.蛋白質(zhì)的自身溶解性特點a.穩(wěn)定性好b.表達量高c.雜蛋白少e.對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易破碎 包含體分離的工藝路線 收集菌體細胞破碎離心分離洗滌除變性劑復性變性溶解1.破碎2.洗滌尿素、Triton-1003.變性溶解SDS、尿素、鹽酸胍、DDT、2ME4.復性a.定義：變性包含體