南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)第二章研究方法

1、第一節(jié)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù) 光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡 : : 觀察顯微結(jié)構(gòu)觀察顯微結(jié)構(gòu) （light microscope)light microscope)顯微鏡顯微鏡 電子顯微鏡電子顯微鏡 : : 觀察亞微結(jié)構(gòu)觀察亞微結(jié)構(gòu) (electron microscope) (electron microscope) 第二章第二章. .細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法分辨率公式分辨率公式n = 介質(zhì)折射率（空氣介質(zhì)折射率（空氣1，水，水1.33，香柏油，香柏油1.5）= 標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角，標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角， sin的最大值為的最大值為1。= 照明光源的波長(zhǎng)，白光照明光源的波

2、長(zhǎng)，白光0.5 m 。橫向分辨率橫向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 縱向分辨率縱向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁(yè)頁(yè)( (一一) )普通光學(xué)顯微鏡的分辨率：普通光學(xué)顯微鏡的分辨率：0.2微米微米一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)思考：思考：如何提高顯微如何提高顯微鏡的分辨能力？鏡的分辨能力？人眼的分辨率：人眼的分辨率：100 m不同光線的波長(zhǎng)不同光線的波長(zhǎng)名名 稱稱 波波 長(zhǎng)長(zhǎng) (nm) 可見(jiàn)光可見(jiàn)光 760 -390 紫外光紫外光 390 -13 X 射線射線 13-0.05 射線射線 1-0.005 電子束電

3、子束 : 100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 （二）普通光學(xué)顯微鏡的成像原理（二）普通光學(xué)顯微鏡的成像原理 光鏡的結(jié)構(gòu)光鏡的結(jié)構(gòu) 光學(xué)部分光學(xué)部分 照明部分照明部分 機(jī)械部分機(jī)械部分在普通光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈在普通光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈半透明狀半透明狀，不易看清。，不易看清。往往將標(biāo)本切片往往將標(biāo)本切片進(jìn)行進(jìn)行染色染色提提高可辨程度高可辨程度。切片機(jī)切片機(jī)染染色色的的原原理理以以紫外線紫外線為光源，照為光源，照射被檢物體發(fā)出能觀射被檢物體發(fā)出能觀察到的熒光。察到的熒光。熒光顯微鏡顯示同一細(xì)胞中的多種結(jié)構(gòu)成分熒光顯微鏡顯示同一細(xì)胞中的多種結(jié)

4、構(gòu)成分細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞骨架通過(guò)致密部分通過(guò)致密部分( (如細(xì)胞核如細(xì)胞核), ),速度慢速度慢通過(guò)疏松部位通過(guò)疏松部位( (如細(xì)胞質(zhì)如細(xì)胞質(zhì)), ),速度快速度快倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡載物臺(tái)的上方：載物臺(tái)的上方： 光源光源 長(zhǎng)焦距長(zhǎng)焦距聚光器聚光器載物臺(tái)的下方：載物臺(tái)的下方： 物鏡物鏡應(yīng)用：直接對(duì)培養(yǎng)的應(yīng)用：直接對(duì)培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行觀察細(xì)胞進(jìn)行觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞(a)：正在分裂生長(zhǎng)的Hela 細(xì)胞(b)：CHO單層細(xì)胞的培養(yǎng) 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖

5、像。體圖像。信噪比信噪比 英文名稱：英文名稱：signal-to-noise ratio;signal to noise ratio定義定義： 特定參數(shù)特定參數(shù)( (信號(hào)信號(hào)) )值與非特異性參數(shù)值與非特異性參數(shù)( (噪噪聲聲) )的比值。的比值。 如實(shí)驗(yàn)中樣品的放射性與本底放射性如實(shí)驗(yàn)中樣品的放射性與本底放射性強(qiáng)度之比；熒光在強(qiáng)度之比；熒光在X X射線底片上所造成的感射線底片上所造成的感光強(qiáng)度與非特異感光背景強(qiáng)度之比等光強(qiáng)度與非特異感光背景強(qiáng)度之比等二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡1.1.透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡分辨率分辨率= = 0.1 nm2.2.掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡-顯示細(xì)胞顯

6、示細(xì)胞表面表面三維立三維立體結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞顯示細(xì)胞斷面斷面三維立三維立體結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較顯微鏡顯微鏡分辨本分辨本領(lǐng)領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光可見(jiàn)光（400-700） 紫外光紫外光（約（約200nm)電子束電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光利用樣品對(duì)光的吸收形成明的吸收形成明暗反差和顏色暗反差和顏色變化變化利用樣品對(duì)電利用樣品對(duì)電子的散射和透子的散射和透射形成

7、明暗反射形成明暗反差差一一. .細(xì)胞組分的分級(jí)分離細(xì)胞組分的分級(jí)分離 第二節(jié)第二節(jié). .細(xì)胞生物學(xué)其他研究方法細(xì)胞生物學(xué)其他研究方法分離不同類型細(xì)胞 大小大小 密度密度 形狀形狀 小小 輕輕 不規(guī)則不規(guī)則 大大 重重 圓形圓形1.1.差速離心法差速離心法 方法：方法：從高速到低速逐級(jí)沉降從高速到低速逐級(jí)沉降 分離對(duì)象：分離對(duì)象：體積、質(zhì)量差別較大的顆粒體積、質(zhì)量差別較大的顆粒二二 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞培養(yǎng) 從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)的生從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存的一種方法。理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存的一種方法。（二）分類（二）分類 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞(a)：正在分裂生長(zhǎng)的Hela 細(xì)胞(b)：CHO單層細(xì)胞的培養(yǎng)三、細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）三、細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）1.1.概念：在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，概念：在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，相同或不同基因型細(xì)胞之間相互相同或不同基因型細(xì)胞之間相互融合的過(guò)程。融合的過(guò)程。2.2.誘導(dǎo)因子：生物：仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)因子：生物：仙臺(tái)病毒 化學(xué)：聚乙二醇化學(xué)：聚乙二醇 物理：電脈沖物理：電脈沖3.3.分類：分類： 異核體：異核體：不同基因的細(xì)胞核融合不同基因的細(xì)胞核融合 同核體：同核體：相同基因的細(xì)胞核融合相