基因工程常規(guī)技術(shù)-相互作用研究技術(shù)

1、相互作用研究技術(shù)相互作用研究技術(shù)v在細(xì)胞的生命活動過程中，諸如在細(xì)胞的生命活動過程中，諸如DNA的復(fù)制與重組、的復(fù)制與重組、mRNA的轉(zhuǎn)錄與修飾，以及病毒的感染與增殖等，都涉的轉(zhuǎn)錄與修飾，以及病毒的感染與增殖等，都涉及到了特定的及到了特定的DNA區(qū)段與蛋白質(zhì)結(jié)合因子或者蛋白質(zhì)因區(qū)段與蛋白質(zhì)結(jié)合因子或者蛋白質(zhì)因子之間的相互作用。為了分析研究參與基因表達(dá)調(diào)控的子之間的相互作用。為了分析研究參與基因表達(dá)調(diào)控的DNA元件，分離鑒定同這些調(diào)控元件結(jié)合的特異的蛋白元件，分離鑒定同這些調(diào)控元件結(jié)合的特異的蛋白質(zhì)因子，近年來已相繼發(fā)展出了一系列專門用于研究相質(zhì)因子，近年來已相繼發(fā)展出了一系列專門用于研究相互作

2、用的實驗技術(shù)?；プ饔玫膶嶒灱夹g(shù)。vDNA與蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)與蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)v蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）v染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是用于研究是用于研究體內(nèi)體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通

3、過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互相互作用的信息。作用的信息。甲醛處理使蛋白質(zhì)與甲醛處理使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)交聯(lián)染色質(zhì)打斷染色質(zhì)打斷沉淀蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)復(fù)合體交聯(lián)復(fù)合體解除交聯(lián)，純化解除交聯(lián)，純化DNA分析分析ChIP技術(shù)的發(fā)展技術(shù)的發(fā)展vChIP-on-chipvChIP-on-chip（定位分析）是一種基于芯片的強（定位分析）是一種基于芯片的強大方法，用于分析表觀遺傳修飾和結(jié)合到特

4、異性大方法，用于分析表觀遺傳修飾和結(jié)合到特異性調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)蛋白的 DNA 序列。序列。 簡要地講，在簡要地講，在 ChIP-on-chip 中，要對蛋白質(zhì)中，要對蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物進(jìn)行交聯(lián)、免復(fù)合物進(jìn)行交聯(lián)、免疫沉淀、純化、擴增和標(biāo)記，隨后使之與多種高疫沉淀、純化、擴增和標(biāo)記，隨后使之與多種高分辨率芯片進(jìn)行雜交。分辨率芯片進(jìn)行雜交。vChIP-Seq基于基于ChIP的測序技術(shù)的測序技術(shù)v首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性）特異性地富集目的地富集目的 蛋白結(jié)合的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的純化與文

5、庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組序列標(biāo)簽精確定位到基因組 上，從而獲得全基因上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段區(qū)段信息。信息。 凝膠阻滯試驗?zāi)z阻滯試驗(EMSA)v凝膠阻滯試驗?zāi)z阻滯試驗 (gel retardation assay)，又叫做，又叫做DNA遷移率變動試驗遷移率變動試驗 (DNA electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，是，是80年代初期出現(xiàn)年代初期出

6、現(xiàn)的用于的用于體外分析體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)相互作用的一種的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)，它具有簡單、快捷等優(yōu)特殊的凝膠電泳技術(shù)，它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當(dāng)前被選作分離純化特定點，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋結(jié)合蛋白質(zhì)的一種經(jīng)典實驗方法。白質(zhì)的一種經(jīng)典實驗方法。v原理：蛋白質(zhì)與原理：蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合后將大大增加分子量，結(jié)合后將大大增加分子量，而凝膠電泳中而凝膠電泳中DNA朝正極移動的距離與其相對朝正極移動的距離與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比，因此，沒有結(jié)合蛋白分子質(zhì)量的對數(shù)成正比，因此，沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的質(zhì)的DNA片段跑得很快，而與蛋白質(zhì)形成復(fù)合片段跑得很快，而與蛋白質(zhì)形

7、成復(fù)合物的物的DNA由于受到阻滯而跑得慢。當(dāng)特定由于受到阻滯而跑得慢。當(dāng)特定DNA片段與細(xì)胞提取物混合后，若復(fù)合物在凝膠電片段與細(xì)胞提取物混合后，若復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率小，就說明該泳中的遷移率小，就說明該DNA可能與提取物可能與提取物中某個蛋白質(zhì)分子發(fā)生中某個蛋白質(zhì)分子發(fā)生 了相互作用。了相互作用。方法：方法：同位素標(biāo)記待測的同位素標(biāo)記待測的DNA片段片段細(xì)胞提取物細(xì)胞提取物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物探針探針DNA溫育溫育PAGE電泳電泳放射自顯影放射自顯影進(jìn)行進(jìn)行DNA凝膠分析凝膠分析 vE M S A 可 以 通 過 加 入 超 量 的 非 標(biāo) 記 的 競 爭可 以 通 過 加

8、 入 超 量 的 非 標(biāo) 記 的 競 爭 D N A (competitor DNA)鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定存在著能夠同某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 (比如比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，以及發(fā)生此種結(jié)合作用的，以及發(fā)生此種結(jié)合作用的DNA序列序列的特異性。的特異性。v如果競爭如果競爭DNA與同位素標(biāo)記的探針與同位素標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的是同一種結(jié)合的是同一種蛋白質(zhì)，那么由于競爭蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針與探針DNA相比是極大超量相比是極大超量的，這樣絕大部分蛋白質(zhì)都會被其競爭結(jié)合掉而使探

9、針的，這樣絕大部分蛋白質(zhì)都會被其競爭結(jié)合掉而使探針DNA仍處于自由的狀態(tài)，不會出現(xiàn)阻滯的條帶。仍處于自由的狀態(tài)，不會出現(xiàn)阻滯的條帶。在凝膠阻滯實驗中競爭在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針與探針DNA之間的之間的競爭作用競爭作用(a)沒有加入競爭沒有加入競爭DNA的的正常的凝膠阻滯實驗，正常的凝膠阻滯實驗，探針探針DNA與特異蛋白質(zhì)與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；(b)加入的超量競爭加入的超量競爭DNA與探針與探針DNA競爭結(jié)合同競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；消失；(c)競爭競爭DNA與探針與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同，

10、出現(xiàn)同(a)一樣的阻滯一樣的阻滯條帶。條帶。 DNaseI足跡試驗足跡試驗v凝膠阻滯試驗?zāi)軌蚪沂境鲈隗w內(nèi)發(fā)生的凝膠阻滯試驗?zāi)軌蚪沂境鲈隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白與蛋白質(zhì)之間相互作用的有關(guān)信息，然而它卻無法確定兩質(zhì)之間相互作用的有關(guān)信息，然而它卻無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。要解答這個問題，則需要應(yīng)用者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。要解答這個問題，則需要應(yīng)用DNaseI足跡試驗足跡試驗 (footprinting assay)。它是一類用。它是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性序列的部位及特性的專門的實驗技術(shù)。的專門的實驗技術(shù)。v在在DNaseI足跡試驗過程中，首先是將待檢

11、測的雙足跡試驗過程中，首先是將待檢測的雙鏈鏈DNA分子用分子用32P作作末端標(biāo)記末端標(biāo)記，并用限制酶去掉，并用限制酶去掉其中的一個末端，得到只一條鏈單末端標(biāo)記雙鏈其中的一個末端，得到只一條鏈單末端標(biāo)記雙鏈DNA分子，而后在體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。分子，而后在體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNaseI (它可沿它可沿著靶著靶DNA作隨機單鏈切割作隨機單鏈切割)消化消化DNA分子并控制分子并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條酶的用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。酸二酯鍵斷裂。v主要步驟：主要步驟： 用用32P標(biāo)記

12、標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用雙鏈末端，并用RE切去一端；切去一端； 加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育； 加入適量加入適量DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。鏈發(fā)生斷裂。v這一反應(yīng)中，這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂！要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂！沉淀沉淀DNA（包括與（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；進(jìn)行進(jìn)行DNA凝膠分析。凝膠分析。 v如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與如果某個蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就

13、會保證該區(qū)段么，它就會保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。 酵母單雜交酵母單雜交v酵母單雜交（酵母單雜交（yeast one-hybrid system)是一項常是一項常用于研究用于研究DNA與蛋白之間的相互作用的方法。與蛋白之間的相互作用的方法。v特點：通過該方法可以識別穩(wěn)定結(jié)合于特點：通過該方法可以識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的上的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) ，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物DNA與與蛋白之間的相互作

14、用，并通過篩選蛋白之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，BD）基本原理：基本原理：順式作用元件順式作用元件報告基因得到表達(dá)報告基因得到表達(dá)激活激活Pmin啟動子啟動子真核生物轉(zhuǎn)錄因子基本構(gòu)件真核生物轉(zhuǎn)錄因子基本構(gòu)件操作流程操作流程cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域（AD）融合）融合導(dǎo)入酵母細(xì)胞導(dǎo)入酵母細(xì)胞基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）（蛋白質(zhì)）順式作用元件順式作

15、用元件激活激活Pmin啟動子啟動子報告基因得到表達(dá)報告基因得到表達(dá)篩選陽性克隆篩選陽性克隆測序分析測序分析cDNA替換了編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換了編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)蛋白基因蛋白基因應(yīng)用領(lǐng)域：應(yīng)用領(lǐng)域：主要用于確定某個主要用于確定某個DNA分子與某個蛋白質(zhì)之間是否分子與某個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；存在相互作用；用于分離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他用于分離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他DNA位點的功能編碼基因；位點的功能編碼基因；驗證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的驗證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；結(jié)合結(jié)構(gòu)域；準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。Yeas

16、t Two Hybrid System (Interaction trap)90年代，紐約大學(xué)的年代，紐約大學(xué)的S. Field等建立。等建立。酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)作用：有效地分離能與一種已知的靶蛋白相作用：有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)互作用的蛋白質(zhì)原理原理許多真核生物的許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結(jié)都是由兩個在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨立的構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域組成。組成。1. 結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域（Domain）合作）合作例如：例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA b

17、inding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS） 轉(zhuǎn)錄機轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄激活轉(zhuǎn)錄只要只要DNA binding domain（DNA-BD）與）與Active domain（AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。實驗發(fā)現(xiàn)：實驗發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達(dá)轉(zhuǎn)錄表達(dá)2. 拆開拆開 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS） 轉(zhuǎn)錄機轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合用重組用重組DNA技術(shù)把技術(shù)把GAL4的

18、兩個的兩個Domain分開，分開，就就喪失喪失了激活效應(yīng)基因的能力。了激活效應(yīng)基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄不能轉(zhuǎn)錄3. 重組重組Domain用重組用重組DNA技術(shù)把這兩個技術(shù)把這兩個Domain分別與兩個分別與兩個不同的多肽連接。不同的多肽連接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在體內(nèi)，蛋白在體內(nèi)，蛋白A與蛋白與蛋白B是否能結(jié)合。是否能結(jié)合。通過效應(yīng)基因是否被激活來檢查：通過效應(yīng)基因是否被激活來檢查：4. 觀察報告基因表達(dá)觀察報告基因表達(dá)上游激活序列（上游激活序列（UAS） 轉(zhuǎn)錄機轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因效應(yīng)基因蛋白蛋白ADNA binding domai

19、n轉(zhuǎn)錄激活轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白蛋白BGAL4的的DB domain與與AD Domain也不能靠也不能靠近，所以仍然不能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。近，所以仍然不能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。不能轉(zhuǎn)錄不能轉(zhuǎn)錄如果蛋白如果蛋白A與蛋白與蛋白B不能相互結(jié)合不能相互結(jié)合上游激活序列（上游激活序列（UAS） 轉(zhuǎn)錄機轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因效應(yīng)基因蛋白蛋白ADNA binding domain轉(zhuǎn)錄激活轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白蛋白B激活轉(zhuǎn)錄激活轉(zhuǎn)錄GAL4的的DB domain與與AD Domain也能靠近，也能靠近，所以能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。所以能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄表達(dá)轉(zhuǎn)錄表達(dá)如果蛋白如果蛋白A與蛋白與蛋白B能相互結(jié)合能相互結(jié)合雙雜交原理雙雜交原理X基因和基因和Y基因產(chǎn)基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，物的相互結(jié)合，導(dǎo)致導(dǎo)致reporter gene表達(dá)。表達(dá)。Reporter gene表達(dá)表達(dá)就可說明就可說明X基因產(chǎn)基因產(chǎn)物與物與Y基因產(chǎn)物能基因產(chǎn)物能結(jié)合。結(jié)合。GST