第5章-中藥制劑中各類化學(xué)成分分析

1、第五章第五章 中藥制劑中各類化學(xué)成分分析中藥制劑中各類化學(xué)成分分析 本章重點(diǎn)：本章重點(diǎn)：1 1、掌握中藥制劑中生物堿、黃酮、三萜皂苷、掌握中藥制劑中生物堿、黃酮、三萜皂苷、醌類成分的定性、定量原理與方法。醌類成分的定性、定量原理與方法。2 2、熟悉、熟悉中藥制劑中揮發(fā)性成分的定性、定量原中藥制劑中揮發(fā)性成分的定性、定量原理與方法。理與方法。 第一節(jié)第一節(jié) 生物堿類成分分析生物堿類成分分析一、概述：一、概述：1 1、生物堿：是指來源于生物界（主要是植物界）的一類、生物堿：是指來源于生物界（主要是植物界）的一類含氮有機(jī)化合物。大多數(shù)有較復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮原子含氮有機(jī)化合物。大多數(shù)有較復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)

2、，氮原子結(jié)合在環(huán)內(nèi)；因結(jié)構(gòu)中有未共用電子對(duì)而多數(shù)具有堿性，結(jié)合在環(huán)內(nèi)；因結(jié)構(gòu)中有未共用電子對(duì)而多數(shù)具有堿性，可以和酸成鹽；大都具有特殊而顯著的生理活性?？梢院退岢甥}；大都具有特殊而顯著的生理活性。2 2、生物體內(nèi)普遍存在的含氮有機(jī)化合物，氨基酸、蛋白、生物體內(nèi)普遍存在的含氮有機(jī)化合物，氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸及某些含氮維生素除外。質(zhì)、核酸及某些含氮維生素除外。3 3、植物里存在的生物堿的含量差別較大，但生物堿大多、植物里存在的生物堿的含量差別較大，但生物堿大多有明顯的生理活性，故常用該成分作定性定量依據(jù)。有明顯的生理活性，故常用該成分作定性定量依據(jù)。在在植物體中，生物堿往往和有機(jī)酸結(jié)合成鹽的形式存

3、在。植物體中，生物堿往往和有機(jī)酸結(jié)合成鹽的形式存在。4 4、含、含生物堿的中藥多分布在防己科、罌粟科、毛茛科、生物堿的中藥多分布在防己科、罌粟科、毛茛科、豆科、小檗科等雙子葉植物中，具體藥材和相應(yīng)成分見豆科、小檗科等雙子葉植物中，具體藥材和相應(yīng)成分見書書P P96969797. .二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：（一）結(jié)構(gòu)特征：生物堿大多由（一）結(jié)構(gòu)特征：生物堿大多由C C、H H、N N、O O元素組成，元素組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多。通常根據(jù)氮雜環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同將結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多。通常根據(jù)氮雜環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同將生物堿分為多種結(jié)構(gòu)類型，常見的有吡咯類、蒎啶類、生物堿分為多種結(jié)構(gòu)類

4、型，常見的有吡咯類、蒎啶類、吲哚里西啶吲哚里西啶類類、莨菪烷類、喹啉類、異喹啉類、莨菪烷類、喹啉類、異喹啉類 、吲哚、吲哚類等。類等。NH吡咯吡咯NH蒎啶蒎啶N吲哚里西吲哚里西啶啶NHHCH3莨菪烷莨菪烷N喹啉喹啉N異喹啉異喹啉NH吲哚吲哚（二）理化性質(zhì)：（二）理化性質(zhì)：1 1、物理性狀：、物理性狀：多數(shù)為無色或白色結(jié)晶性固體，小分子多數(shù)為無色或白色結(jié)晶性固體，小分子生物堿有揮發(fā)性。個(gè)別具有升華性。有的有熒光，多數(shù)生物堿有揮發(fā)性。個(gè)別具有升華性。有的有熒光，多數(shù)味苦。味苦。2 2、旋光性：大多數(shù)生物堿有旋光性，多呈左旋。旋光、旋光性：大多數(shù)生物堿有旋光性，多呈左旋。旋光性與生理活動(dòng)密切相關(guān)。一

5、般左旋體性與生理活動(dòng)密切相關(guān)。一般左旋體生理活性生理活性強(qiáng)。強(qiáng)。3 3、溶解性：、溶解性：大多數(shù)生物堿難溶于水，易溶于苯、乙醚、氯仿等親大多數(shù)生物堿難溶于水，易溶于苯、乙醚、氯仿等親脂性有機(jī)溶劑。脂性有機(jī)溶劑。與酸結(jié)合生成鹽后水溶性增加，但在水中的溶解度有與酸結(jié)合生成鹽后水溶性增加，但在水中的溶解度有差異。一般無機(jī)酸鹽的水溶性大于有機(jī)酸鹽；無機(jī)酸鹽差異。一般無機(jī)酸鹽的水溶性大于有機(jī)酸鹽；無機(jī)酸鹽中含氧酸鹽的溶解度大于鹵代酸鹽。小分子有機(jī)酸鹽大中含氧酸鹽的溶解度大于鹵代酸鹽。小分子有機(jī)酸鹽大于大分子有機(jī)酸鹽。于大分子有機(jī)酸鹽。季銨型生物堿、具有半極性的季銨型生物堿、具有半極性的N N、O O配位

6、鍵的生物堿、配位鍵的生物堿、酰胺堿易溶于水。酰胺堿易溶于水。某些小分子或液體生物堿既可溶于水也可溶于親脂性某些小分子或液體生物堿既可溶于水也可溶于親脂性有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑。含有酸性官能團(tuán)或酯鍵的生物堿還可溶于一些堿液或含有酸性官能團(tuán)或酯鍵的生物堿還可溶于一些堿液或熱苛性堿液。熱苛性堿液。4 4、沉淀反應(yīng)：、沉淀反應(yīng)：大多數(shù)生物堿在酸性水溶液中可以與某些試劑生成大多數(shù)生物堿在酸性水溶液中可以與某些試劑生成不溶于水的復(fù)鹽或分子復(fù)合物。不溶于水的復(fù)鹽或分子復(fù)合物。 沉淀試劑多為分子量沉淀試劑多為分子量較大的碘化物復(fù)鹽，重金屬鹽，大分子酸類等。常用較大的碘化物復(fù)鹽，重金屬鹽，大分子酸類等。常用的有：碘

7、化鉍鉀、碘的有：碘化鉍鉀、碘- -碘化鉀等。碘化鉀等。注意假陽性的干擾。它們是酸水浸出液中的蛋白質(zhì)注意假陽性的干擾。它們是酸水浸出液中的蛋白質(zhì)、多肽、鞣質(zhì)。所以進(jìn)行沉淀反應(yīng)前，要凈化。、多肽、鞣質(zhì)。所以進(jìn)行沉淀反應(yīng)前，要凈化。5 5、顯色反應(yīng)：、顯色反應(yīng)：生物堿在一定生物堿在一定pHpH條件下可與一些酸性染料生成有色條件下可與一些酸性染料生成有色絡(luò)合物，可被氯仿等有機(jī)溶劑定量提出。絡(luò)合物，可被氯仿等有機(jī)溶劑定量提出。結(jié)構(gòu)中含有酯鍵的生物堿可與異羥肟酸鐵試劑反應(yīng)結(jié)構(gòu)中含有酯鍵的生物堿可與異羥肟酸鐵試劑反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色。產(chǎn)生紫紅色。6 6、堿性：、堿性：氮原子的雜化方式（最主要因素）氮原子的雜化方式

8、（最主要因素）SPSP3 3SPSP2 2SPSP；堿性集團(tuán)：胍基堿性集團(tuán)：胍基 季銨堿季銨堿 N- N-烷雜環(huán)烷雜環(huán) 脂肪胺脂肪胺 芳胺類（芳雜環(huán)）芳胺類（芳雜環(huán)） 酰胺酰胺7 7、紫外光譜特征：、紫外光譜特征：結(jié)構(gòu)中有共軛體系的生物堿均有紫外吸收。結(jié)構(gòu)中有共軛體系的生物堿均有紫外吸收。結(jié)構(gòu)中的氮原子與發(fā)色團(tuán)直接連接或參與發(fā)色團(tuán)的生結(jié)構(gòu)中的氮原子與發(fā)色團(tuán)直接連接或參與發(fā)色團(tuán)的生物堿，其吸收峰位置與測(cè)定時(shí)溶劑的物堿，其吸收峰位置與測(cè)定時(shí)溶劑的pHpH值有關(guān)。值有關(guān)。三、定性鑒別：三、定性鑒別：（一）一般理化鑒別：（一）一般理化鑒別：主要應(yīng)用生物堿沉淀反應(yīng)主要應(yīng)用生物堿沉淀反應(yīng)(1)(1)生物堿

9、的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加硅鎢酸生成淡黃生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加硅鎢酸生成淡黃色或灰白色色或灰白色沉淀沉淀。(2)(2)生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘- -碘化鉀試劑碘化鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生棕色或褐色沉淀。數(shù)滴，產(chǎn)生棕色或褐色沉淀。 BHBH+ + + I + I2 2-K-K+ +I I- - BI BI2 2HIHI（棕、褐色）（棕、褐色） + K+ K+ +(3)(3)生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘化鉍鉀、碘化生物堿的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘化鉍鉀、碘化汞鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生紅棕色沉淀、類白色沉淀。汞鉀試劑數(shù)滴，產(chǎn)生紅棕

10、色沉淀、類白色沉淀。 BHBH+ + + BiI+ BiI3 3KI BBiIKI BBiI3 3HIHI（紅棕色）（紅棕色） + K+ K+ + BH BH+ + + HgI + HgI2 2KI BHgIKI BHgI2 22HI2HI（類白色）（類白色） + K+ K+ + （4 4）生物堿的水溶液在中性條件下加苦味酸生成黃色沉淀。生物堿的水溶液在中性條件下加苦味酸生成黃色沉淀。（5 5）雷氏銨鹽與季銨堿生成紅色沉淀。）雷氏銨鹽與季銨堿生成紅色沉淀。（6 6）酸水浸出液中的蛋白質(zhì)、多肽、鞣質(zhì)等也可以與酸水浸出液中的蛋白質(zhì)、多肽、鞣質(zhì)等也可以與沉淀試劑發(fā)生反應(yīng)，沉淀試劑發(fā)生反應(yīng)，造成假陽性

11、結(jié)果。所以進(jìn)行沉淀造成假陽性結(jié)果。所以進(jìn)行沉淀反應(yīng)前，要凈化除去干擾成分。反應(yīng)前，要凈化除去干擾成分。（7 7）中藥制劑中有兩種以上）中藥制劑中有兩種以上中藥含有生物堿中藥含有生物堿成分，沉成分，沉淀反應(yīng)定性鑒別就難以說明問題。淀反應(yīng)定性鑒別就難以說明問題。（二）色譜鑒別：（二）色譜鑒別：1 1、薄層色譜法：首先用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛∩飰A，提取液、薄層色譜法：首先用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛∩飰A，提取液經(jīng)濃縮后直接或經(jīng)過必要的凈化后，點(diǎn)在薄層板上，層經(jīng)濃縮后直接或經(jīng)過必要的凈化后，點(diǎn)在薄層板上，層析后噴灑生物堿顯色劑，再根據(jù)生物堿的特性，選擇特析后噴灑生物堿顯色劑，再根據(jù)生物堿的特性，選擇特異的顏色反應(yīng)或熒

12、光波長進(jìn)行觀察，并應(yīng)用純品對(duì)照或異的顏色反應(yīng)或熒光波長進(jìn)行觀察，并應(yīng)用純品對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)藥材對(duì)照，有時(shí)須作陰性對(duì)照后才能確定成分。標(biāo)準(zhǔn)藥材對(duì)照，有時(shí)須作陰性對(duì)照后才能確定成分。吸附劑：硅膠、氧化鋁。吸附劑：硅膠、氧化鋁。展開劑：多用氯仿、苯等低極性溶劑，可加入其他溶展開劑：多用氯仿、苯等低極性溶劑，可加入其他溶劑調(diào)整展開劑的極性。劑調(diào)整展開劑的極性。因硅膠顯弱酸性，強(qiáng)堿性的生物堿在硅膠板上成鹽，因硅膠顯弱酸性，強(qiáng)堿性的生物堿在硅膠板上成鹽，易形成復(fù)斑，故用硅膠為吸附劑時(shí)，一般易形成復(fù)斑，故用硅膠為吸附劑時(shí)，一般應(yīng)用堿性系統(tǒng)應(yīng)用堿性系統(tǒng)展開劑展開劑或使薄層分離在或使薄層分離在堿性環(huán)境堿性環(huán)境下進(jìn)行。

13、下進(jìn)行。顯色劑：常用改良碘化鉍鉀試劑，有時(shí)噴碘化鉍鉀之顯色劑：常用改良碘化鉍鉀試劑，有時(shí)噴碘化鉍鉀之后再噴硝酸鈉試劑，可使樣本斑點(diǎn)更加清晰。后再噴硝酸鈉試劑，可使樣本斑點(diǎn)更加清晰。也可用碘蒸氣，硫酸鈰等試劑顯色。也可用碘蒸氣，硫酸鈰等試劑顯色。 2 2、紙色譜法：、紙色譜法：可用于生物堿鹽或游離堿的鑒別?？捎糜谏飰A鹽或游離堿的鑒別。主要是以水為固定相的正相紙色譜法，分離效果常主要是以水為固定相的正相紙色譜法，分離效果常取決于流動(dòng)相的性質(zhì)。取決于流動(dòng)相的性質(zhì)。利用紙色譜來快速鑒別烏頭中雙酯類生物堿和醇胺利用紙色譜來快速鑒別烏頭中雙酯類生物堿和醇胺類生物堿有其獨(dú)到之處。類生物堿有其獨(dú)到之處。所用

14、顯色劑基本和薄層色譜法相同，但含硫酸的試所用顯色劑基本和薄層色譜法相同，但含硫酸的試劑不適用。劑不適用。 3 3、高效液相色譜法：、高效液相色譜法：適合結(jié)構(gòu)十分相似的生物堿的鑒別。適合結(jié)構(gòu)十分相似的生物堿的鑒別。在恒定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都具有一定在恒定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都具有一定的保留時(shí)間，的保留時(shí)間，保留時(shí)間保留時(shí)間可作為定性鑒別的參數(shù)。用供試品可作為定性鑒別的參數(shù)。用供試品與對(duì)照品相應(yīng)的與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間進(jìn)行比較來鑒別。保留時(shí)間進(jìn)行比較來鑒別。若色譜條件不能恒定，將已知對(duì)照品加入供試品中，利若色譜條件不能恒定，將已知對(duì)照品加入供試品中，利用峰面積或峰高加大法

15、進(jìn)行檢識(shí)。用峰面積或峰高加大法進(jìn)行檢識(shí)。為保護(hù)色譜柱，供試品要經(jīng)濾膜過濾后再進(jìn)樣，色譜柱為保護(hù)色譜柱，供試品要經(jīng)濾膜過濾后再進(jìn)樣，色譜柱前也要使用保護(hù)柱。前也要使用保護(hù)柱。4 4、氣相色譜法：適用于具揮發(fā)性且加熱不分解的生物堿、氣相色譜法：適用于具揮發(fā)性且加熱不分解的生物堿的分離和鑒定。的分離和鑒定。四、含量測(cè)定：四、含量測(cè)定：（一）總生物堿含量測(cè)定：（一）總生物堿含量測(cè)定：1 1、化學(xué)反應(yīng)法：使用此法，要求樣品供試液中總生物堿成、化學(xué)反應(yīng)法：使用此法，要求樣品供試液中總生物堿成分純度高。常用于處方藥味少，內(nèi)含成分簡單的制劑。包括分純度高。常用于處方藥味少，內(nèi)含成分簡單的制劑。包括重量分析法和

16、容量分析法（滴定分析法），其中酸堿滴定法重量分析法和容量分析法（滴定分析法），其中酸堿滴定法最常用。最常用。酸堿滴定法：酸堿滴定法：游離生物堿不溶于水，可先將生物堿溶于過游離生物堿不溶于水，可先將生物堿溶于過量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴。量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴。生物堿鹽在水或乙醇介質(zhì)中用強(qiáng)堿溶液滴定。一般使其溶生物堿鹽在水或乙醇介質(zhì)中用強(qiáng)堿溶液滴定。一般使其溶于于9090乙醇溶液中（因在乙醇溶液中（因在70%70%90%90%乙醇介質(zhì)中終點(diǎn)比在水中乙醇介質(zhì)中終點(diǎn)比在水中明顯），可用標(biāo)準(zhǔn)堿乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。明顯），可用標(biāo)準(zhǔn)堿乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。若選擇的溶劑及指

17、示終點(diǎn)方法合適，還可用非水滴定法。若選擇的溶劑及指示終點(diǎn)方法合適，還可用非水滴定法。 2 2、分光光度法：多采用單波長光度法測(cè)定中藥制劑中總、分光光度法：多采用單波長光度法測(cè)定中藥制劑中總生物堿成分的含量。測(cè)定波長可以是被測(cè)生物堿本身的生物堿成分的含量。測(cè)定波長可以是被測(cè)生物堿本身的吸收波長，也可是加入試劑顯色后的波長。供試品要經(jīng)吸收波長，也可是加入試劑顯色后的波長。供試品要經(jīng)過分離凈化才可測(cè)定。過分離凈化才可測(cè)定。(1)(1)直接測(cè)定：直接測(cè)定：原理：不經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，利用生物堿自身的光吸收直原理：不經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，利用生物堿自身的光吸收直接進(jìn)行分光光度法測(cè)定的方法。接進(jìn)行分光光度法測(cè)定的方法。

18、特點(diǎn)：不加試劑。特點(diǎn)：不加試劑。適用范圍：一般用于藥味較少、干擾不大的中藥制劑適用范圍：一般用于藥味較少、干擾不大的中藥制劑中總生物堿的含量測(cè)定。注意溶液中有其他有色物質(zhì)或中總生物堿的含量測(cè)定。注意溶液中有其他有色物質(zhì)或有紫外吸收、熒光吸收的物質(zhì)時(shí)要先排除。有紫外吸收、熒光吸收的物質(zhì)時(shí)要先排除。（2 2）離子對(duì)萃取比色法：用于中藥制劑中微量生物堿）離子對(duì)萃取比色法：用于中藥制劑中微量生物堿類成分的含量測(cè)定。類成分的含量測(cè)定。原理：原理：生物堿生物堿在一定在一定pHpH介質(zhì)中，與一些試劑定量地結(jié)合介質(zhì)中，與一些試劑定量地結(jié)合為有色離子對(duì)，此離子對(duì)可定量轉(zhuǎn)溶于某些有機(jī)溶劑，為有色離子對(duì)，此離子對(duì)可

19、定量轉(zhuǎn)溶于某些有機(jī)溶劑，然后在一定波長下測(cè)定有機(jī)溶劑的吸收度，即可按分光然后在一定波長下測(cè)定有機(jī)溶劑的吸收度，即可按分光光度法計(jì)算生物堿的含量。光度法計(jì)算生物堿的含量。常用做離子對(duì)配位體的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚常用做離子對(duì)配位體的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚藍(lán)（藍(lán)（BTBBTB）等）等. .酚類和羧酸類有苦味酸、苯甲酸等。酚類和羧酸類有苦味酸、苯甲酸等。無機(jī)離子有無機(jī)離子有ClCl- -BrBr- -等。等。酸性染料比色法：酸性染料比色法：特點(diǎn)：在一定特點(diǎn)：在一定pHpH介質(zhì)中，生物堿鹽陽離子與一些酸性染料介質(zhì)中，生物堿鹽陽離子與一些酸性染料陰離子定量地結(jié)合為有色離子對(duì)，此離子對(duì)可定量溶

20、于某陰離子定量地結(jié)合為有色離子對(duì)，此離子對(duì)可定量溶于某些有機(jī)溶劑，然后在一定波長下測(cè)定此有機(jī)溶劑的吸收度些有機(jī)溶劑，然后在一定波長下測(cè)定此有機(jī)溶劑的吸收度，即可按分光光度法計(jì)算生物堿的含量。，即可按分光光度法計(jì)算生物堿的含量。 BH BH+ +In+In- - (BH (BH+ +InIn- -) BH) BH+ +InIn- -注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：a a選擇適宜的選擇適宜的pHpH值是本法關(guān)鍵之一：值是本法關(guān)鍵之一：pHpH值低生物堿呈陽離值低生物堿呈陽離子而酸性染料為游離狀態(tài)。子而酸性染料為游離狀態(tài)。 pHpH值高則酸性染料呈陰離子值高則酸性染料呈陰離子但生物堿為游離狀態(tài)。兩情況陰陽離子均

21、不能定量結(jié)合。但生物堿為游離狀態(tài)。兩情況陰陽離子均不能定量結(jié)合。pHpH值的選擇根據(jù)值的選擇根據(jù)染料性質(zhì)和生物堿堿性確定。染料性質(zhì)和生物堿堿性確定。b b選擇適宜的有機(jī)溶劑是本法關(guān)鍵之二：要求對(duì)離子對(duì)溶選擇適宜的有機(jī)溶劑是本法關(guān)鍵之二：要求對(duì)離子對(duì)溶解度好且無水，常用氯仿、二氯甲烷等。解度好且無水，常用氯仿、二氯甲烷等。c c選擇適宜的酸性染料是本法關(guān)鍵之三：最好用選擇適宜的酸性染料是本法關(guān)鍵之三：最好用溴麝香草溴麝香草酚藍(lán)（酚藍(lán)（BTBBTB）。）。d d應(yīng)防止操作時(shí)混入水分。有機(jī)溶劑提取液可加入脫水劑應(yīng)防止操作時(shí)混入水分。有機(jī)溶劑提取液可加入脫水劑（如無水硫酸鈉）或經(jīng)濾紙濾過除去微量水分。

22、（如無水硫酸鈉）或經(jīng)濾紙濾過除去微量水分。雷氏鹽比色法：雷氏鹽比色法：特點(diǎn)：特點(diǎn)：雷氏鹽雷氏鹽(NH(NH4 4Cr(NHCr(NH3 3) )2 2(SCN)(SCN)4 4HH2 2O)O)在在酸性介質(zhì)中可與生物堿類成分定量地生成難溶于酸性介質(zhì)中可與生物堿類成分定量地生成難溶于水的水的生物堿雷氏鹽沉淀生物堿雷氏鹽沉淀，此沉淀易溶于，此沉淀易溶于丙酮，丙酮，其其丙酮溶液所呈現(xiàn)的吸收特征，是由于分子結(jié)構(gòu)中丙酮溶液所呈現(xiàn)的吸收特征，是由于分子結(jié)構(gòu)中的硫氰酸鉻銨部分，而不是結(jié)合的生物堿部分，的硫氰酸鉻銨部分，而不是結(jié)合的生物堿部分，其吸收值與生物堿樣品本身或溶劑無關(guān)。其吸收值與生物堿樣品本身或溶劑

23、無關(guān)。因此，因此，有兩種方法計(jì)算樣品中生物堿的含量：有兩種方法計(jì)算樣品中生物堿的含量：a a將沉淀分離洗凈，溶于丙酮（或甲醇），于將沉淀分離洗凈，溶于丙酮（或甲醇），于520520526nm526nm（溶于甲醇，（溶于甲醇，maxmax為為427nm427nm）波長處用分光光度）波長處用分光光度儀測(cè)定吸收度，換算生物堿的含量。儀測(cè)定吸收度，換算生物堿的含量。雷氏鹽雷氏鹽在丙酮中的在丙酮中的摩爾吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)為106.5(106.5(單鹽，即雷氏鹽與單鹽，即雷氏鹽與1 1分子生物堿分子生物堿結(jié)合生成的鹽結(jié)合生成的鹽) )或或213.0(213.0(雙鹽雙鹽) )。故可根據(jù)其吸收值。故可根

24、據(jù)其吸收值A(chǔ) A按按下式直接計(jì)算樣品下式直接計(jì)算樣品量量而不需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。而不需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 W =（ A/）MV式中，式中， W：生物堿雷氏鹽沉淀的重量（：生物堿雷氏鹽沉淀的重量（mg）；）； M：生：生物堿雷氏鹽沉淀的分子量物堿雷氏鹽沉淀的分子量; ; A：吸收度；：吸收度；：硫氰酸鉻硫氰酸鉻銨摩爾吸收系數(shù)銨摩爾吸收系數(shù)；V：丙酮液毫升數(shù)。：丙酮液毫升數(shù)。 本方法不需要標(biāo)準(zhǔn)品，但需注意生物堿本方法不需要標(biāo)準(zhǔn)品，但需注意生物堿雷氏鹽沉淀雷氏鹽沉淀是生成單鹽還是雙鹽，并要注意樣品的凈化。是生成單鹽還是雙鹽，并要注意樣品的凈化。b b也可以精密加入過量雷氏鹽試劑，濾除生成的也可以精密加入過量

25、雷氏鹽試劑，濾除生成的生物堿生物堿雷氏鹽沉淀，之后用分光光度法測(cè)定濾液中過量雷氏雷氏鹽沉淀，之后用分光光度法測(cè)定濾液中過量雷氏鹽的含量，間接計(jì)算生物堿的含量。鹽的含量，間接計(jì)算生物堿的含量。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：A A雷氏鹽使用前新鮮配制，沉淀反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。雷氏鹽使用前新鮮配制，沉淀反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。B B供試品為稀的水溶液，沉淀前應(yīng)濃縮。供試品為稀的水溶液，沉淀前應(yīng)濃縮。溶液中有干擾溶液中有干擾物質(zhì)時(shí)，應(yīng)事先經(jīng)過純化處理。物質(zhì)時(shí)，應(yīng)事先經(jīng)過純化處理。C C雷氏鹽的丙酮或丙酮雷氏鹽的丙酮或丙酮- -水溶液的吸收值隨時(shí)間而變化水溶液的吸收值隨時(shí)間而變化，故應(yīng)盡快測(cè)定。，故應(yīng)盡快測(cè)定。異羥肟

26、酸鐵反應(yīng)：異羥肟酸鐵反應(yīng)：特點(diǎn)：含酯鍵的生物堿在堿性介質(zhì)中加熱，酯鍵水解后特點(diǎn)：含酯鍵的生物堿在堿性介質(zhì)中加熱，酯鍵水解后產(chǎn)生的羧基與羥胺反應(yīng)生成異羥肟酸，異羥肟酸再與產(chǎn)生的羧基與羥胺反應(yīng)生成異羥肟酸，異羥肟酸再與FeFe3+3+生成紫紅色的生成紫紅色的異羥肟酸鐵，在一定濃度符合郎伯比異羥肟酸鐵，在一定濃度符合郎伯比爾定律，可用分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。爾定律，可用分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。注意事項(xiàng)：適用于含酯鍵的生物堿的含量測(cè)定，但供試注意事項(xiàng)：適用于含酯鍵的生物堿的含量測(cè)定，但供試品溶液中不能含有其他酯類或羧酸類成分。品溶液中不能含有其他酯類或羧酸類成分。（二）單體生物堿含量測(cè)定：多用色譜法。

27、（二）單體生物堿含量測(cè)定：多用色譜法。1 1、薄層色譜（掃描）法：薄層色譜技術(shù)對(duì)生物堿類成分分、薄層色譜（掃描）法：薄層色譜技術(shù)對(duì)生物堿類成分分離和測(cè)定需要結(jié)合生物堿的特性提取和純化，離和測(cè)定需要結(jié)合生物堿的特性提取和純化，后使用堿性展后使用堿性展開劑或在堿性環(huán)境中展開開劑或在堿性環(huán)境中展開。在薄層掃描定量時(shí)，須首先作一。在薄層掃描定量時(shí)，須首先作一工作曲線，目的是考察工作曲線是否通過原點(diǎn)，其次需要找工作曲線，目的是考察工作曲線是否通過原點(diǎn)，其次需要找出線性范圍，以便摸索樣品點(diǎn)樣量。此外薄層掃描定量還需出線性范圍，以便摸索樣品點(diǎn)樣量。此外薄層掃描定量還需要采用隨行點(diǎn)樣法，以便盡量減小誤差要采用

28、隨行點(diǎn)樣法，以便盡量減小誤差. .注意：注意：選用吸附劑、展開劑及顯色方法與薄層鑒別相似，選用吸附劑、展開劑及顯色方法與薄層鑒別相似，但更嚴(yán)格。但更嚴(yán)格。顯色劑常用改良碘化鉍鉀，揮干展開劑后噴灑，顯色要均顯色劑常用改良碘化鉍鉀，揮干展開劑后噴灑，顯色要均勻勻. .2 2、高效液相色譜、高效液相色譜法法：生物堿類成分進(jìn)行高效液相：生物堿類成分進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，可采用正相、反相和離子對(duì)色譜，色譜分析時(shí)，可采用正相、反相和離子對(duì)色譜，其中以反相高效液相色譜應(yīng)用較多。在反相高效其中以反相高效液相色譜應(yīng)用較多。在反相高效液相色譜中為了克服游離硅醇基的影響，采取了液相色譜中為了克服游離硅醇基的影響，

29、采取了以下的措施：以下的措施：(1)(1)流動(dòng)相方面的改進(jìn)：流動(dòng)相方面的改進(jìn)： A A、加入硅醇基抑制劑，最常用的硅醇基抑制劑是加入硅醇基抑制劑，最常用的硅醇基抑制劑是三乙胺三乙胺; ;B B、在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑, ,掩蔽掩蔽生物堿類成生物堿類成分的堿性基團(tuán)分的堿性基團(tuán); ;C C、在流動(dòng)相中加入季銨鹽試劑，例如在水在流動(dòng)相中加入季銨鹽試劑，例如在水- -甲醇甲醇流動(dòng)相中加入流動(dòng)相中加入0.01mol0.01molL L的溴化四甲基胺。的溴化四甲基胺。 (2)(2)固定相方面的改進(jìn)：選擇碳鏈較短的鍵合相硅固定相方面的改進(jìn)：選擇碳鏈較短的鍵合相硅膠填料，例如用膠填料

30、，例如用C C8 8比比C C1818好。好。含量測(cè)定操作基本流程：含量測(cè)定操作基本流程：樣品供試液制備：樣品供試液制備：樣品根據(jù)生物堿通性提取、凈樣品根據(jù)生物堿通性提取、凈化、定容制備供試液。化、定容制備供試液。標(biāo)準(zhǔn)液配制：標(biāo)準(zhǔn)液配制：先配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再配制成系列先配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再配制成系列標(biāo)準(zhǔn)液。標(biāo)準(zhǔn)液。測(cè)試條件選擇：測(cè)試條件選擇： 色譜柱（多用色譜柱（多用C C1818）、流動(dòng)相）、流動(dòng)相( (多多用甲醇用甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水水) )、流速（多用、流速（多用1ml/min1ml/min）、）、檢測(cè)器檢測(cè)器( (多用紫外檢測(cè)器多用紫外檢測(cè)器) )、測(cè)試波長（多為被測(cè)、測(cè)試

31、波長（多為被測(cè)物最大吸收波長）。物最大吸收波長）。選擇定量方式，之后進(jìn)樣、檢測(cè)、計(jì)算含量。選擇定量方式，之后進(jìn)樣、檢測(cè)、計(jì)算含量。3 3、氣相色譜法：氣相色譜法適用于有揮發(fā)性的，、氣相色譜法：氣相色譜法適用于有揮發(fā)性的，遇熱不分解的單體生物堿的含量測(cè)定。遇熱不分解的單體生物堿的含量測(cè)定。 第二節(jié)第二節(jié) 黃酮類成分分析黃酮類成分分析一、概述：一、概述：1 1、黃酮：以前黃酮類化合物主要是指基本母核為、黃酮：以前黃酮類化合物主要是指基本母核為2-2-苯苯基色原酮類的化合物，現(xiàn)在則是泛指兩個(gè)苯環(huán)（基色原酮類的化合物，現(xiàn)在則是泛指兩個(gè)苯環(huán)（A A與與B B環(huán)）通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。

32、環(huán)）通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。是一類重要的天然色素，也是中藥中一類重要的有效是一類重要的天然色素，也是中藥中一類重要的有效成分。成分。OO12345678OO12345678123456OO12345678123456色原酮2苯基色原酮C6C3C62 2、黃酮類化合物分布廣泛，多分布于高等植物中，集中、黃酮類化合物分布廣泛，多分布于高等植物中，集中在被子植物。以唇形科、玄參科、爵麻科、菊科等存在較在被子植物。以唇形科、玄參科、爵麻科、菊科等存在較多。常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在。在花、葉、多。常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在。在花、葉、果中多為苷；在木質(zhì)部多為苷元。含黃

33、酮類成分的常用中果中多為苷；在木質(zhì)部多為苷元。含黃酮類成分的常用中藥見書藥見書P P106106。3 3、生理活性：多種多樣，作用不強(qiáng)，毒性不大。、生理活性：多種多樣，作用不強(qiáng)，毒性不大。心血管方面作用心血管方面作用 鎮(zhèn)咳、祛痰鎮(zhèn)咳、祛痰保肝保肝 抗菌、抗病毒抗菌、抗病毒其它：瀉下、解痙、抗癌、抑制愛滋病毒等其它：瀉下、解痙、抗癌、抑制愛滋病毒等二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：（一）結(jié)構(gòu)特征：（一）結(jié)構(gòu)特征：依據(jù)依據(jù)C C環(huán)的成環(huán)、氧化和取代方式的環(huán)的成環(huán)、氧化和取代方式的差異，將重要的天然黃酮類化合物苷元結(jié)構(gòu)分類如下：差異，將重要的天然黃酮類化合物苷元結(jié)構(gòu)分類如下：1 1、黃

34、酮和黃酮醇黃酮和黃酮醇2 2、二氫黃酮和二氫黃酮醇二氫黃酮和二氫黃酮醇：黃酮的：黃酮的2 2、3 3位雙鍵被飽和位雙鍵被飽和3 3、異黃酮和二氫異黃酮異黃酮和二氫異黃酮：由由2-2-苯基變?yōu)楸交優(yōu)?-3-苯基取代苯基取代4 4、查爾酮和二氫查爾酮查爾酮和二氫查爾酮：可以轉(zhuǎn)化：可以轉(zhuǎn)化5 5、橙酮橙酮：橙酮：橙酮C C環(huán)為五元環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)為五元環(huán)結(jié)構(gòu)。6 6、花色素類和黃烷醇類花色素類和黃烷醇類：無羰基。：無羰基。另外大多數(shù)另外大多數(shù)黃酮類化合物黃酮類化合物可結(jié)合成可結(jié)合成苷，苷苷，苷中的糖分類有中的糖分類有一糖：一糖：葡萄糖、鼠李糖等；葡萄糖、鼠李糖等；二糖：二糖：槐糖、龍膽二糖、蕓香糖、新橙皮

35、糖槐糖、龍膽二糖、蕓香糖、新橙皮糖等等三糖：三糖：龍膽三糖龍膽三糖等等（二）理化性質(zhì)：（二）理化性質(zhì)：1 1、性狀：苷元為結(jié)晶性固體，苷為無定形粉末。、性狀：苷元為結(jié)晶性固體，苷為無定形粉末。2 2、溶解性：、溶解性：游離苷元易溶于甲、乙醇，乙酸乙酯，乙醚及稀堿液中游離苷元易溶于甲、乙醇，乙酸乙酯，乙醚及稀堿液中，不溶或難溶于水。游離苷元的母核上引入羥基，水溶性，不溶或難溶于水。游離苷元的母核上引入羥基，水溶性增加，且增加，且水溶性水溶性與羥基數(shù)目成正比，羥基甲基化，脂溶性與羥基數(shù)目成正比，羥基甲基化，脂溶性增加，水溶性降低。增加，水溶性降低。黃酮苷類易溶于熱水，甲醇，乙醇。難溶或不溶于親脂黃

36、酮苷類易溶于熱水，甲醇，乙醇。難溶或不溶于親脂性有機(jī)溶劑，一般多糖苷在水中的溶解度大于單糖苷。性有機(jī)溶劑，一般多糖苷在水中的溶解度大于單糖苷。3 3、酸堿性：、酸堿性：黃酮類化合物分子中具有酚羥基，故顯酸性。黃酮類化合物分子中具有酚羥基，故顯酸性。黃酮類化合物因?yàn)榉肿又械狞S酮類化合物因?yàn)榉肿又械?吡喃酮環(huán)上的吡喃酮環(huán)上的1-1-氧原子有氧原子有未共用電子對(duì)，可接受質(zhì)子而顯弱堿性，與強(qiáng)酸結(jié)合生成未共用電子對(duì)，可接受質(zhì)子而顯弱堿性，與強(qiáng)酸結(jié)合生成钅钅羊（羊（yangyang）鹽，其極不穩(wěn)定，可加水分解。不同類型的）鹽，其極不穩(wěn)定，可加水分解。不同類型的黃酮溶于濃硫酸時(shí)，常表現(xiàn)出不同的顏色，可用于鑒

37、別。黃酮溶于濃硫酸時(shí)，常表現(xiàn)出不同的顏色，可用于鑒別。4 4、顯色反應(yīng)：與分子中的酚羥基及、顯色反應(yīng)：與分子中的酚羥基及-吡喃酮環(huán)有吡喃酮環(huán)有關(guān)。關(guān)。還原反應(yīng)：還原反應(yīng)：a a鹽酸鹽酸- -鎂粉反應(yīng)：鎂粉反應(yīng)：將樣品的甲醇或乙醇液，加入少將樣品的甲醇或乙醇液，加入少許鎂粉振搖，再滴加幾滴濃鹽酸，即可。許鎂粉振搖，再滴加幾滴濃鹽酸，即可?，F(xiàn)象：泡沫處呈紅色?，F(xiàn)象：泡沫處呈紅色。應(yīng)用：黃酮，黃酮醇，二氫黃酮（醇）應(yīng)用：黃酮，黃酮醇，二氫黃酮（醇）b b四氫硼鈉反應(yīng)四氫硼鈉反應(yīng): :樣品的甲醇液，加等量樣品的甲醇液，加等量2%NaBH2%NaBH4 4的甲的甲醇液，加濃鹽酸或硫酸，醇液，加濃鹽酸或硫

38、酸，即可。即可?，F(xiàn)象：溶液生成紫色或紫紅色現(xiàn)象：溶液生成紫色或紫紅色應(yīng)用：二氫黃酮類專屬反應(yīng)應(yīng)用：二氫黃酮類專屬反應(yīng) 與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng): :分子中具有分子中具有3-3-羥基，羥基，4-4-羰羰基或基或5-5-羥基，羥基，4-4-羰基或鄰二酚羥基的黃酮有此反應(yīng)羰基或鄰二酚羥基的黃酮有此反應(yīng). .a a三氯化鋁顯色三氯化鋁顯色: :樣品的乙醇溶液加三氯化鋁乙醇溶液顯鮮樣品的乙醇溶液加三氯化鋁乙醇溶液顯鮮黃色熒光。（含黃色熒光。（含4 4-OH-OH或或7 7，4-OH4-OH顯天藍(lán)色熒光顯天藍(lán)色熒光）b b鋯鹽鋯鹽- -枸櫞酸反應(yīng)枸櫞酸反應(yīng): :樣品的甲醇液樣品的甲

39、醇液加加2%ZrOCl2%ZrOCl2 2/MeOH,/MeOH,生成生成黃色鋯絡(luò)合物，說明有黃色鋯絡(luò)合物，說明有3-OH3-OH或或5-OH5-OH。加。加2%2%枸櫞酸，仍呈鮮枸櫞酸，仍呈鮮黃色說明有黃色說明有3-OH3-OH，黃色溶液顯著褪去，無，黃色溶液顯著褪去，無3-OH3-OH有有5-OH5-OH。c c醋酸鎂顯色醋酸鎂顯色: :紙片上滴加樣品液，噴醋酸鎂甲醇液，加熱紙片上滴加樣品液，噴醋酸鎂甲醇液，加熱干燥，干燥，UVUV觀察。觀察?，F(xiàn)象：二氫黃酮（醇），天藍(lán)色熒光?，F(xiàn)象：二氫黃酮（醇），天藍(lán)色熒光。 黃酮、黃酮醇、異黃酮，顯黃黃酮、黃酮醇、異黃酮，顯黃- -橙黃橙黃- -褐色褐

40、色熒光熒光.5 5、紫外光譜特征：、紫外光譜特征：黃酮類化合物具有黃酮類化合物具有2-2-苯基色原酮苯基色原酮基本母核基本母核而具有特定吸而具有特定吸收峰，常有兩個(gè)較強(qiáng)的吸收帶。收峰，常有兩個(gè)較強(qiáng)的吸收帶。I I帶帶(300-400nm) B(300-400nm) B環(huán)桂皮?；h(huán)桂皮酰基IIII帶帶(240-285nm) A(240-285nm) A環(huán)苯甲?；h(huán)苯甲?；S酮類化合物中加入一些位移試劑如甲醇鈉、醋酸鈉、黃酮類化合物中加入一些位移試劑如甲醇鈉、醋酸鈉、三氯化鋁等，可使最大吸收波長發(fā)生位移，選擇性提高，三氯化鋁等，可使最大吸收波長發(fā)生位移，選擇性提高，還可消除雜質(zhì)干擾，有利于含量測(cè)定

41、。還可消除雜質(zhì)干擾，有利于含量測(cè)定。三、定性鑒別：三、定性鑒別：（一）顯色反應(yīng)：（一）顯色反應(yīng)：1 1、鹽酸、鹽酸- -鎂粉反應(yīng)：鎂粉反應(yīng)：操作：操作：將中藥制劑用適當(dāng)方法提取分離，制成供試將中藥制劑用適當(dāng)方法提取分離，制成供試品溶液。常用的品溶液。常用的提取提取溶劑有甲醇、乙醇或乙酸乙酯溶劑有甲醇、乙醇或乙酸乙酯等；取樣品液等；取樣品液5 510mL10mL，先，先加入少許鎂粉加入少許鎂粉，然后，然后加入加入數(shù)滴鹽酸數(shù)滴鹽酸，如果有黃酮、黃酮醇或其二氫化合物存，如果有黃酮、黃酮醇或其二氫化合物存在，數(shù)分鐘后則可產(chǎn)生在，數(shù)分鐘后則可產(chǎn)生紅色紅色或紫紅色?；蜃霞t色。注意：注意：為避免為避免供試品

42、溶液本身顏色的干擾，可觀供試品溶液本身顏色的干擾，可觀察泡沫顏色，泡沫為紅色，示陽性察泡沫顏色，泡沫為紅色，示陽性。查耳酮、橙酮等單純?cè)跐恹}酸作用下也會(huì)發(fā)生顏查耳酮、橙酮等單純?cè)跐恹}酸作用下也會(huì)發(fā)生顏色變化，須做空白對(duì)照。即不加鎂粉只加濃鹽酸觀色變化，須做空白對(duì)照。即不加鎂粉只加濃鹽酸觀察，產(chǎn)生紅色即表明溶液中有上述成分。察，產(chǎn)生紅色即表明溶液中有上述成分。2 2、與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)：、與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)： 黃酮類成分能與金屬離子如黃酮類成分能與金屬離子如AlAl3+3+，ZrZr4+4+等產(chǎn)等產(chǎn)生絡(luò)合作用，產(chǎn)生熒光或顏色加深等。生絡(luò)合作用，產(chǎn)生熒光或顏色加深等。 絡(luò)合作用的條件是

43、黃酮類成分必須具備下絡(luò)合作用的條件是黃酮類成分必須具備下述條件之一，即述條件之一，即5-5-羥基羥基(a)(a)、3-3-羥基羥基(b)(b)或鄰二或鄰二酚羥基酚羥基(c)(c)，(a)(a)、(b)(b)都是羥基與都是羥基與4 4位羰基共同位羰基共同與金屬離子形成絡(luò)合物。與金屬離子形成絡(luò)合物。 （二）薄層色譜法：黃酮類成分最常用的定性分析方（二）薄層色譜法：黃酮類成分最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄層，常用的吸附劑有硅膠與聚酰法。一般采用吸附薄層，常用的吸附劑有硅膠與聚酰胺，也可用纖維素、硅酸鎂等。胺，也可用纖維素、硅酸鎂等。 硅膠色譜分離弱極性化合物較好硅膠色譜分離弱極性化合物較好 聚

44、酰胺色譜分離含游離酚羥基的黃酮及其苷較理想聚酰胺色譜分離含游離酚羥基的黃酮及其苷較理想 纖維素薄層則適用于分離多糖纖維素薄層則適用于分離多糖苷苷混合物混合物 展開后的顯色反應(yīng)可采用在紫外光下觀察熒光和展開后的顯色反應(yīng)可采用在紫外光下觀察熒光和噴顯色劑相配合的方法。噴顯色劑相配合的方法。操作步驟：操作步驟：供試液制備、對(duì)照液制備、準(zhǔn)備薄層板、供試液制備、對(duì)照液制備、準(zhǔn)備薄層板、點(diǎn)樣點(diǎn)樣 、準(zhǔn)備展開劑、展開、顯色、色譜識(shí)別。、準(zhǔn)備展開劑、展開、顯色、色譜識(shí)別。1 1、硅膠薄層色譜：、硅膠薄層色譜： 用硅膠分離黃酮成分，遵循正相色譜層析規(guī)律，化用硅膠分離黃酮成分，遵循正相色譜層析規(guī)律，化合物極性越強(qiáng)

45、，所需溶劑的極性越大。合物極性越強(qiáng)，所需溶劑的極性越大。 其其R Rf f值順序如下：值順序如下：RCHRCH3 3RHROCHRHROCH3 3R-O-R-O-糖糖ROHROH常用的展開溶劑系統(tǒng)有：常用的展開溶劑系統(tǒng)有： 甲苯甲苯- -甲酸乙酯甲酸乙酯- -甲酸甲酸(541)(541)，分離黃酮甙元；，分離黃酮甙元； 苯苯- -甲醇甲醇(955)(955)，分離黃酮甙元；，分離黃酮甙元； 苯苯- -甲醇甲醇- -乙酸乙酸(3555)(3555)，分離黃酮甙；，分離黃酮甙； 氯仿氯仿- -甲醇甲醇(82)(82)，分離黃酮甙元及甙；，分離黃酮甙元及甙； 苯苯- -乙酸乙酯乙酸乙酯(7.52.5

46、)(7.52.5)或苯或苯- -丙酮丙酮(91)(91)，分離黃酮，分離黃酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分；甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分； 甲苯甲苯- -甲酸乙酯甲酸乙酯- -甲酸甲酸(541)(541)，分離雙黃酮成分。，分離雙黃酮成分。 展開劑系統(tǒng)中各組分的配比可根據(jù)薄層色譜的需要加展開劑系統(tǒng)中各組分的配比可根據(jù)薄層色譜的需要加以調(diào)整。以調(diào)整。2 2聚酰胺薄層色譜：聚酰胺薄層色譜用于分離含游離聚酰胺薄層色譜：聚酰胺薄層色譜用于分離含游離酚羥基的黃酮甙與甙元較好。由于各種黃酮類成分取代酚羥基的黃酮甙與甙元較好。由于各種黃酮類成分取代基團(tuán)的性質(zhì)、多少和位置的不同，與聚酰胺形成氫鍵的基團(tuán)的

47、性質(zhì)、多少和位置的不同，與聚酰胺形成氫鍵的能力有所差異而得到分離（能力有所差異而得到分離（酚羥基越多酚羥基越多R Rf f 越小越?。?。）。 一般說來，一般說來，聚酰胺薄層色譜聚酰胺薄層色譜展開劑中大多含醇、酸展開劑中大多含醇、酸、水。常用的溶劑系統(tǒng)有：、水。常用的溶劑系統(tǒng)有：甲醇甲醇- -水水(82)(82)，分離黃酮，分離黃酮甙元及甙甙元及甙，苯，苯- -丁酮丁酮- -甲醇甲醇(622)(622)，分離黃酮甙元；，分離黃酮甙元；乙酸乙酸- -水水(12)(12)，分離黃酮甙。，分離黃酮甙。3 3、纖維素薄層色譜：纖維素薄層色譜可用于分離黃、纖維素薄層色譜：纖維素薄層色譜可用于分離黃酮甙類酮

48、甙類( (尤其是尤其是多糖苷多糖苷) )，原理與紙色譜相同，常用的，原理與紙色譜相同，常用的展開劑為展開劑為正丁醇正丁醇- -乙酸乙酸- -水水(415)(415)的上層溶液的上層溶液 。注意：黃酮類成分的纖維素色譜行為是分子中酚羥基注意：黃酮類成分的纖維素色譜行為是分子中酚羥基增多時(shí)，增多時(shí)，R Rf f值減少；當(dāng)分子中羥基為甲基或甲氧基所值減少；當(dāng)分子中羥基為甲基或甲氧基所取代時(shí)，取代時(shí)，R Rf f值增加。值增加。四、含量測(cè)定：四、含量測(cè)定：（一）總黃酮含量測(cè)定：用分光光度法（一）總黃酮含量測(cè)定：用分光光度法1 1、直接測(cè)定法：利用黃酮類自身的光吸收，直接以最、直接測(cè)定法：利用黃酮類自身

49、的光吸收，直接以最大吸收波長測(cè)定其吸收度，以蘆丁等為對(duì)照品計(jì)算含量大吸收波長測(cè)定其吸收度，以蘆丁等為對(duì)照品計(jì)算含量。多用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。多用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：一般用于藥味較少，干擾不大的中藥制劑一般用于藥味較少，干擾不大的中藥制劑中總黃酮類化合物的含量測(cè)定。中總黃酮類化合物的含量測(cè)定。 max max 黃酮醇黃酮醇:285:285358nm;358nm;黃酮黃酮:304:304350nm;350nm;二氫黃酮（醇）：二氫黃酮（醇）：270270295nm295nm；異黃酮：異黃酮：245245270nm270nm；查耳酮：查耳酮：340340390nm390nm。2 2、加試劑顯色測(cè)

50、定法：利用黃酮類化合物與金、加試劑顯色測(cè)定法：利用黃酮類化合物與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)來顯色測(cè)定。屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)來顯色測(cè)定。 最常用的是與鋁鹽反應(yīng)顯色，試劑為三氯化最常用的是與鋁鹽反應(yīng)顯色，試劑為三氯化鋁或硝酸鋁。測(cè)定總黃酮時(shí)常用蘆丁作對(duì)照品，鋁或硝酸鋁。測(cè)定總黃酮時(shí)常用蘆丁作對(duì)照品，對(duì)照品與供試品中均加入顯色試劑，對(duì)照品與供試品中均加入顯色試劑，多用標(biāo)準(zhǔn)曲多用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定含量。線法測(cè)定含量。（二）單體黃酮成分的含量測(cè)定：（二）單體黃酮成分的含量測(cè)定：1 1、薄層色譜（掃描）法：測(cè)定中藥制劑中單體黃酮、薄層色譜（掃描）法：測(cè)定中藥制劑中單體黃酮類成分的類成分的關(guān)鍵是分離關(guān)鍵是分離。樣品

51、經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后，。樣品經(jīng)有機(jī)溶劑或水提取后，可用硅膠、纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析，以達(dá)到分離的可用硅膠、纖維素或聚酰胺進(jìn)行層析，以達(dá)到分離的目的。目的。 層析后將含有待測(cè)成分的色斑用薄層掃描儀直接層析后將含有待測(cè)成分的色斑用薄層掃描儀直接測(cè)定，多用雙波長薄層掃描法。測(cè)定，多用雙波長薄層掃描法。2 2、高效液相色譜法：、高效液相色譜法：由于黃酮類化合物在紫外光區(qū)有較強(qiáng)的吸收，故使用由于黃酮類化合物在紫外光區(qū)有較強(qiáng)的吸收，故使用HPLCHPLC法檢測(cè)靈敏度較高，法檢測(cè)靈敏度較高，因此該法在黃酮類單體成分的定因此該法在黃酮類單體成分的定量分析中最常用。量分析中最常用。 HPLCHPLC色譜條件分正

52、相和反相色譜兩類色譜條件分正相和反相色譜兩類，其中反相色譜應(yīng)用較多。，其中反相色譜應(yīng)用較多。黃酮類成分的黃酮類成分的RP-HPLCRP-HPLC：固定相大多用固定相大多用C C1818鍵合相，流動(dòng)鍵合相，流動(dòng)相常用甲醇相常用甲醇- -水水- -乙酸或乙腈乙酸或乙腈- -水。水。黃酮類成分的黃酮類成分的NP-HPLCNP-HPLC：固定相多用氰基或氨基鍵合相硅固定相多用氰基或氨基鍵合相硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對(duì)小一點(diǎn)。膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要相對(duì)小一點(diǎn)。多用于多用于羥基或乙酰化黃酮類的含量測(cè)定。羥基或乙酰化黃酮類的含量測(cè)定。檢測(cè)器：多用紫外檢測(cè)器。檢測(cè)器：多用紫外

53、檢測(cè)器。 第三節(jié)第三節(jié) 三萜皂苷類成分分析三萜皂苷類成分分析一、概述：一、概述：1 1、三萜皂苷：三萜是由、三萜皂苷：三萜是由3030個(gè)碳原子組成的萜類化合物，根個(gè)碳原子組成的萜類化合物，根據(jù)據(jù)“異戊二烯定則異戊二烯定則”，多數(shù)三萜被認(rèn)為是由，多數(shù)三萜被認(rèn)為是由6 6個(gè)異戊二烯（個(gè)異戊二烯（三十個(gè)碳）縮合而成，三十個(gè)碳）縮合而成，該類化合物在自然界分布廣泛，有該類化合物在自然界分布廣泛，有的以游離形式存在，更多則以與糖結(jié)合成苷的形式存在，的以游離形式存在，更多則以與糖結(jié)合成苷的形式存在，該苷類化合物該苷類化合物多數(shù)可溶于水，水溶液振搖后產(chǎn)生似肥皂溶多數(shù)可溶于水，水溶液振搖后產(chǎn)生似肥皂溶液樣泡沫

54、，故被稱為三萜皂苷。該類皂苷多具有羧基，所液樣泡沫，故被稱為三萜皂苷。該類皂苷多具有羧基，所以有時(shí)又稱之為酸性皂苷。以有時(shí)又稱之為酸性皂苷。 R2OHOHR1O3206ROHHHCOOHO32 2、生理活性：三萜類化合物具有溶血、抗炎、生理活性：三萜類化合物具有溶血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗生育等作用?？股茸饔谩? 3、分布：三萜皂苷廣泛存在于自然界中，菌、分布：三萜皂苷廣泛存在于自然界中，菌類、蕨類、單子葉、雙子葉植物、動(dòng)物及海類、蕨類、單子葉、雙子葉植物、動(dòng)物及海洋生物中均有分布，尤以雙子葉植物中分布洋生物中均有分布，尤以雙子葉植物中分布最多。含三萜皂苷的具

55、體藥材和其相應(yīng)成分最多。含三萜皂苷的具體藥材和其相應(yīng)成分見書見書P P114114. .二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)：（一）結(jié)構(gòu)特征：四環(huán)三萜和五環(huán)三萜是兩種在中藥中（一）結(jié)構(gòu)特征：四環(huán)三萜和五環(huán)三萜是兩種在中藥中分布最廣的三萜類化合物。分布最廣的三萜類化合物。1 1、四環(huán)三萜：基本母核為環(huán)戊烷駢多氫菲，、四環(huán)三萜：基本母核為環(huán)戊烷駢多氫菲，1717位為位為個(gè)碳原子組成的側(cè)鏈，母核上有個(gè)角甲基。它包括達(dá)個(gè)碳原子組成的側(cè)鏈，母核上有個(gè)角甲基。它包括達(dá)瑪烷型、羊毛脂甾烷型、大瑪烷型、羊毛脂甾烷型、大戟戟烷型、原萜烷型、葫蘆素烷型、原萜烷型、葫蘆素烷型烷型 、楝烷型等。、楝烷型等。

56、2 2、五環(huán)三萜：基本骨架為多氫蒎的五環(huán)結(jié)構(gòu)，包括齊五環(huán)三萜：基本骨架為多氫蒎的五環(huán)結(jié)構(gòu)，包括齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型等。墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型等。甾體皂苷：皂苷元由甾體皂苷：皂苷元由2727個(gè)碳組成個(gè)碳組成, ,共有共有A A、B B、C C、D D、E E和和F F六個(gè)環(huán)，也有泡沫反應(yīng)和溶血性，要注意它與三六個(gè)環(huán)，也有泡沫反應(yīng)和溶血性，要注意它與三萜皂萜皂苷的區(qū)別。苷的區(qū)別。（二）理化性質(zhì)：（二）理化性質(zhì)：1 1、性狀：游離三萜多有完好的結(jié)晶，但三萜皂苷多為、性狀：游離三萜多有完好的結(jié)晶，但三萜皂苷多為無定型粉末無定型粉末, ,具有苦味和辛辣味具有苦味和

57、辛辣味, ,對(duì)人體粘膜有刺激性對(duì)人體粘膜有刺激性, ,還具有吸濕性。還具有吸濕性。 2 2、熔點(diǎn)與旋光性：熔點(diǎn)或分解點(diǎn)在、熔點(diǎn)與旋光性：熔點(diǎn)或分解點(diǎn)在200200350350之間，之間，且均有旋光性。且均有旋光性。3 3、溶解性：、溶解性：游離三萜游離三萜溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑，不溶于水。溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑，不溶于水。 三萜皂苷三萜皂苷可溶于水，易溶于熱水、熱甲醇、可溶于水，易溶于熱水、熱甲醇、熱乙醇熱乙醇和稀醇，難溶于低極性有機(jī)溶劑。和稀醇，難溶于低極性有機(jī)溶劑。正丁醇與水分層且可正丁醇與水分層且可很好的溶解皂苷，常作為皂苷的提取溶劑。很好的溶解皂苷，常作為皂苷的提取溶劑。4 4、顯色反

58、應(yīng)：三萜化合物（苷元和苷）在無水條件、顯色反應(yīng)：三萜化合物（苷元和苷）在無水條件下，與強(qiáng)酸、三氯乙酸或下，與強(qiáng)酸、三氯乙酸或LewisLewis酸（氯化鋅、三氯化酸（氯化鋅、三氯化鋁、三氯化銻）作用，會(huì)產(chǎn)生顏色變化或熒光，放久鋁、三氯化銻）作用，會(huì)產(chǎn)生顏色變化或熒光，放久褪色。但全飽和且褪色。但全飽和且3 3位又無羥基或羰基的位又無羥基或羰基的三萜三萜化合物化合物呈陰性反應(yīng)。呈陰性反應(yīng)。（1 1）醋酐）醋酐- -濃硫酸反應(yīng)（濃硫酸反應(yīng)（L-BL-B反應(yīng)）：將樣品溶于醋反應(yīng)）：將樣品溶于醋酐中，加濃硫酸酐中，加濃硫酸- -醋酐（醋酐（1 1：2020），可產(chǎn)生黃），可產(chǎn)生黃紅紅紫紫藍(lán)等顏色變化，

59、最后褪色（藍(lán)等顏色變化，最后褪色（三萜化合物以顯黃色和三萜化合物以顯黃色和紅色為主，甾體化合物以顯藍(lán)色和綠色為主紅色為主，甾體化合物以顯藍(lán)色和綠色為主）。）。（2 2）氯化銻反應(yīng)：將樣品氯仿或醇溶液點(diǎn)于濾紙上，）氯化銻反應(yīng)：將樣品氯仿或醇溶液點(diǎn)于濾紙上，噴以噴以20%20%五氯化銻的氯仿溶液（或五氯化銻的氯仿溶液（或三氯化銻飽和的氯三氯化銻飽和的氯仿溶液仿溶液），干燥后），干燥后60607070加熱，出現(xiàn)藍(lán)色、灰藍(lán)色，加熱，出現(xiàn)藍(lán)色、灰藍(lán)色，灰紫色等多種顏色斑點(diǎn)?；易仙榷喾N顏色斑點(diǎn)。5 5、表面活性：絕大多數(shù)三萜皂苷水溶液強(qiáng)烈振搖后、表面活性：絕大多數(shù)三萜皂苷水溶液強(qiáng)烈振搖后可產(chǎn)生持久的泡沫

60、?？僧a(chǎn)生持久的泡沫。6 6、溶血作用：大多數(shù)皂苷的水溶液有溶血作用，但、溶血作用：大多數(shù)皂苷的水溶液有溶血作用，但少數(shù)皂苷有抗溶血作用。少數(shù)皂苷有抗溶血作用。三、定性鑒別：包括理化鑒別和薄層色譜鑒別。薄層色三、定性鑒別：包括理化鑒別和薄層色譜鑒別。薄層色譜鑒別準(zhǔn)確度高，是最常用的鑒別方法。理化鑒別包括譜鑒別準(zhǔn)確度高，是最常用的鑒別方法。理化鑒別包括泡沫反應(yīng)和化學(xué)顯色反應(yīng)鑒別，多用于含皂苷的原料藥泡沫反應(yīng)和化學(xué)顯色反應(yīng)鑒別，多用于含皂苷的原料藥和組成藥物少，皂苷含量高的中藥制劑。和組成藥物少，皂苷含量高的中藥制劑。( (一一) )泡沫反應(yīng)：泡沫反應(yīng)： 取藥品粉末約取藥品粉末約1g1g，加水，加水