常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué)PPT課件

1、細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)cytochemistry and histochemistry是以細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)為基礎(chǔ)，運(yùn)用物理的和化學(xué)的技術(shù)方法顯示細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中各種化學(xué)成分，并對(duì)這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定性、定位、定量（半定量），從而分析研究生物在生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞組織的代謝、機(jī)能及形態(tài)變化規(guī)律。其在醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第1頁/共61頁細(xì)胞和組織化學(xué)方法其原則上是運(yùn)用已知的化學(xué)反應(yīng)過程使細(xì)胞組織內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)在原位形成可見的最終有色產(chǎn)物。 光學(xué)顯微鏡觀察顯微鏡細(xì)胞組織化學(xué) 電子顯微鏡觀察電鏡細(xì)胞化學(xué) 免疫技術(shù)方法 免疫組織化學(xué) 免疫電鏡細(xì)胞化學(xué) 用細(xì)胞和組織化學(xué)方法顯示細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中各種酶的定性

2、、定位、定量酶組織化學(xué)酶組織化學(xué)宏觀酶組織化學(xué) 光鏡酶組織化學(xué) 電鏡酶組織化學(xué)第2頁/共61頁小腦挫傷，蘇木素伊紅染色（HE）第3頁/共61頁酶組織化學(xué)染色脫氫酶NBTNBT: 第4頁/共61頁酶組織化學(xué)染色SDH第5頁/共61頁細(xì)胞和組織化學(xué)方法研究的范圍1. 1. 組織細(xì)胞中的無機(jī)物質(zhì)：主要包括鉀、鈣、鋅、銅、汞等金屬；氯化物、磷酸鹽等鹽類；以及各種無機(jī)放射性物質(zhì)等。2. 2. 組織細(xì)胞中的有機(jī)物質(zhì)：主要包括中性脂肪、磷脂類、膽固醇、中性和酸性粘多糖類、糖原、粘液蛋白、淀粉、類淀粉物質(zhì)、黑色素、脂褐素、膽色素、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNADNA、RNARNA、各種維生素等。3. 3. 組織細(xì)

3、胞中各種酶類：如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶等-蛋白質(zhì)。第6頁/共61頁細(xì)胞和組織化學(xué)方法的特點(diǎn):1. 必須最大限度地保存細(xì)胞和組織中各種化學(xué)成分和/或酶的活性，以保證定性、定量研究；2. 必須最有效地保持細(xì)胞組織固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以保證化學(xué)成分和各種酶在細(xì)胞組織中的定位；3. 必須掌握被檢測(cè)的化學(xué)物質(zhì)特性，如水溶性、脂溶性、溶解度及特異反應(yīng)等；4. 必須掌握被檢測(cè)各種酶的特性，如酶的功能、酶存在的特定部位、酶反應(yīng)的適宜溫度和酸堿度、酶的特異激活劑和抑制劑、影響酶活性的因素等；5. 必須做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，借助陽性和陰性對(duì)照，正確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，注意識(shí)別假陽性

4、結(jié)果。第7頁/共61頁細(xì)胞和組織化學(xué)方法的基本技術(shù)取材取材固定固定水洗水洗脫水脫水透明透明浸蠟與包埋浸蠟與包埋切片切片染色染色: :脫蠟、脫苯、水化、染色、脫水、脫蠟、脫苯、水化、染色、脫水、透明透明封片封片第8頁/共61頁一、取材基本要求：取材是否正確、恰當(dāng)，直接影響切片的制作及正確診斷。1取材越快越新鮮越好，防止組織自溶、腐敗。2取材刀要鋒利，切取時(shí)刀口垂直地切??；嚴(yán)禁擠壓，嚴(yán)禁用鉗鑷鉗夾，以免使組織或細(xì)胞變形造成人為的損傷。3取材大小，一般長(zhǎng)l-3厘米，寬1-2厘米，厚度為0.3-0.5厘米?？蒲杏霉忡R標(biāo)本不超過1cm 1cm 1cm，電鏡標(biāo)本直徑約0.5mm。過大材料在短時(shí)間內(nèi)不易固定

5、透，影響效果。4 要兼顧病變部位與正常部位。 5 盡可能在低溫條件下操作，04。 第9頁/共61頁各器官取材方法：腦：取材應(yīng)能反應(yīng)出腦各部位的變化，一般采用冠狀切面法，全腦包括（橋腦、延腦、小腦和脊髓頸段及脈絡(luò)叢）。取材部位如下：額極； 中央前后回；海馬；內(nèi)囊； 丘腦； 枕葉；脈絡(luò)叢；中腦； 橋腦； 延髓； 小腦； 脊髓頸段。取材時(shí)要包括軟腦膜、室腦膜或軟脊膜（刀要鋒利）。垂體：取垂體時(shí)注意前、中、后葉和垂體柄都要兼顧，從前向后縱切。 第10頁/共61頁心：一般悄況下將心房、瓣膜、心室一起取下。也可分別取一塊病變部位連同正常組織。也可單獨(dú)取心室肌，乳突肌組織。肺：常規(guī)取材應(yīng)包括左、右兩肺（五個(gè)

6、肺葉），可根據(jù)病變需要決定取材塊數(shù)，特殊情況下為區(qū)別在哪個(gè)肺葉上取的材可用形狀做標(biāo)志，在記錄時(shí)記清楚。腎：取材包括被膜、皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂，并要求區(qū)別左、右腎。胰：常規(guī)取胰體部，為長(zhǎng)方形必要時(shí)加取胰頭、胰尾。肝：取長(zhǎng)方形或三角形均可，帶被膜。脾：取材帶被膜。第11頁/共61頁管腔臟器：取材時(shí)注意方向大、小腸：考慮環(huán)行肌肉，沿腸管的長(zhǎng)軸?。v切）；食管：以橫切面為宜；胃：常規(guī)取材以胃底為好；氣管：橫切、縱切均要有?？傊芮慌K器的各層構(gòu)造都要取到。為了防止標(biāo)本入固定液后變形，將材料取下后（如剪開的大小腸、胃等組織）將漿膜面鋪在濾紙上，然后入固定液內(nèi)，這樣能防止或減少組織受壓變形與收縮。第12頁/共6

7、1頁二、組織固定組織固定的意義：組織固定是做好切片的重要步驟之一，如果首次固定失敗，再重新固定也不如一次固定成功好，無法補(bǔ)救。處死動(dòng)物立即取材，這時(shí)組織及細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活力。迅速將其固定能有效地防止組織及細(xì)胞發(fā)生死后的一系列變化。固定的關(guān)鍵在于取材后盡可能地及時(shí)地將取到的材料進(jìn)行固定，抑制其死后變化的進(jìn)展，盡力使組織接近于生前狀態(tài)。另外，在標(biāo)本制做過程中經(jīng)過許多步驟，為了防止組織成份的溶解消失，有必要及時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，從而有利于保存。 第13頁/共61頁組織固定的目的：阻止死后變化，防止組織的自溶與腐敗。使組織的結(jié)構(gòu)保存下來，如蛋白質(zhì)，脂肪、糖元、酶等各種成份與生活時(shí)的形態(tài)

8、相仿。便于染色，同時(shí)對(duì)組織有媒染作用，使不同的組織成份對(duì)染料有不同的親和力，使細(xì)胞各部易于受色。能使組織硬化，為做薄切片打下基礎(chǔ)。 第14頁/共61頁組織固定的注意事項(xiàng)：. 材料塊不能過大；固定器皿不易過??；固定液量不易過少，大約是固定材料體積的2040倍。. 根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同固定液，如做糖元檢查就不能用含水的固定液，做電鏡檢查就必須用鋨酸固定液等。 第15頁/共61頁固定液：用以固定組織的藥劑。固定液分為兩大類： 單純固定液：僅由一種藥劑組成。 混合固定液（或復(fù)合固定液）：由二種以上的藥劑組成的固定液。固定液選擇標(biāo)準(zhǔn)：具有強(qiáng)的穿透力，固定均勻，能迅速滲透組織內(nèi)部，使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持生

9、活時(shí)期的相仿狀態(tài)。不使組織過度收縮與膨脹而變形。能迅速使組織中的蛋白質(zhì)，糖、脂肪等物質(zhì)凝固而成為不溶性物質(zhì)。使組織達(dá)到一定的硬度，便于切片制作、染色。價(jià)格便宜，容易買到，同時(shí)要配制方便。 第16頁/共61頁常用的單純固定液乙醇（酒精）alcohol 甲醛（福爾馬林）（緩沖液配制） formalin重鉻酸鉀 potassium bichromate 苦味酸 picric acid鋨酸 osmic acid 丙酮 acetone 冰醋酸 glacial acetic acid 多聚甲醛緩沖固定液 paraformaldehyde戊二醛磷酸緩沖固定液 glutaric dialdehyde第17頁/

10、共61頁1. 乙醇（酒精）Alcohol它是一種還原劑，不能與氧化劑混合使用。固定用酒精最好濃度在7 080，酒精濃度愈大，組織收縮愈嚴(yán)重。反之，濃度太低起不到固定作用。由于酒精能沉淀白蛋白，球蛋白和核蛋白，而后者的沉淀物易溶于水，所以用酒精固定的標(biāo)本細(xì)胞核染色不佳；酒精還可溶解脂肪、血紅蛋白和多種色素。所以做脂肪染色必須要用冰凍切片。第18頁/共61頁乙醇優(yōu)點(diǎn)：使用方便、經(jīng)濟(jì)，國(guó)內(nèi)市售有：95 的乙醇和無水乙醇（100）；能硬化組織，起固定作用； 也是一種最常用的脫水劑缺點(diǎn)：穿透力小，由于表面硬化，固定液不容易滲透到組織中去，所以用乙醇固定的組織材料要??；組織收縮嚴(yán)重;染色效果一般。第19頁

11、/共61頁2. 甲醛（福爾馬林）formalin是一種還原劑，不能與氧化劑混合使用。它是一種最常用的固定液，可應(yīng)用于組織學(xué)、酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等染色，最好臨用時(shí)現(xiàn)配。目前認(rèn)為甲醛是一種致癌劑、致畸劑等。甲醛液是一種無色透明極易揮發(fā)有強(qiáng)烈刺激性氣味的液體。商品甲醛為3740甲醛水溶液，也即福爾馬林。一般固定用配制的濃度為48，習(xí)慣上稱為10或20的福爾馬林。此液可按前述取材大小在常溫下固定24小時(shí)48小時(shí)。若需要快速固定，可加溫到7080或者加溫煮沸10分鐘即可達(dá)到固定要求，這種快速固定組織塊不宜過厚或過大。缺點(diǎn)是組織收縮較嚴(yán)重。第20頁/共61頁配法：將商品甲醛1份與9份自來水（最好用P

12、BS等緩沖液配制）混合即為4濃度的甲醛固定液。優(yōu)點(diǎn)：滲透力較強(qiáng)；組織收縮??；細(xì)胞核染色較好。 缺點(diǎn)：一般質(zhì)量較差的Formalin在低溫下久存容易產(chǎn)生一種白色的沉淀物，稱為三聚甲醛，即付醛。后者經(jīng)氧化便成為甲酸而使溶液呈酸性，可影響細(xì)胞核的嗜鹼性染色。糾正辦法：可在備用甲醛溶液中放入適量的碳酸鈣、碳酸鎂或簡(jiǎn)便的辦法可在溶液中投入適量的大理石或者白粉筆作為中和劑。另外酸性福爾馬林固定的組織多易產(chǎn)生一種褐色或黑色素稱福爾馬林色素，在切片上見到的是黑色小顆粒，這種色素顆粒即不溶于水也不溶于酒精，影響染色效果和切片的觀察。第21頁/共61頁除掉福爾馬林色素顆粒的辦法： Schridde氏法2 5氨水

13、lml75酒精 200ml切片脫蠟后經(jīng)70酒精時(shí)用上液浸泡半小時(shí)或稍長(zhǎng)一些時(shí)間，然后水洗再行染色。Verocay氏法l氫氧化鉀 lml70酒精 100ml切片脫蠟后經(jīng) 8 0酒精時(shí)入上液處理10分鐘，再經(jīng)70酒精入水。第22頁/共61頁3. 鋨酸（四氧化鋨，osmic acid）它并不是酸，實(shí)際上是一種金屬氧化物，其水溶液呈中性反應(yīng)，為淡黃色結(jié)晶，價(jià)昂貴，只適用于特殊染色中，如制作電鏡超薄切片前的小組織塊固定。鋨酸為強(qiáng)氧化劑，不可與酒精及甲醛混用。鋨酸極易揮發(fā)，氣味有強(qiáng)烈的刺激性和固定作用，用時(shí)必須十分小心，要有防護(hù)措施。特點(diǎn)：它固定的組織必須小而薄，其主要優(yōu)點(diǎn)是能將組織固定與生活時(shí)期相仿。鋨

14、酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑，特別對(duì)顯示線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器有良好的效果。 配制：電鏡超薄切片的小組織塊后固定用鋨酸濃度為1%。0.2mol/L 磷酸緩沖液 pH7.27.4 10ml + 2%四氧化鋨水溶液四氧化鋨水溶液 10ml。第23頁/共61頁4. 丙酮 acetone丙酮能使蛋白質(zhì)沉淀，其滲透力強(qiáng)但對(duì)組織收縮嚴(yán)重；對(duì)細(xì)胞核的固定欠佳。目前在組織化學(xué)中，特別是酶的保存方面多采用冷丙酮固定法，主要用于磷酸酶及氧化酶的固定，有時(shí)也用于混合固定液中。 第24頁/共61頁5. 多聚甲醛緩沖固定液 paraformaldehyde多聚甲醛 4g4g，加入0.1mol/L0.1mol/L磷酸緩沖

15、液 pH7.2 100mlpH7.2 100ml中，加熱60608080溶解。固定15min15min24h,024h,044。主要用于科研組織標(biāo)本的固定，尤其用于免疫組織化學(xué)染色的組織固定，保護(hù)抗原決定簇不被封閉。6.戊二醛磷酸緩沖固定液 glutaric dialdehyde 25%戊二醛10ml，加入0.1mol/L0.1mol/L磷酸緩沖液 pH7.2pH7.27.47.4 90ml 90ml中。固定時(shí)間為60min, 060min, 044。主要用于科研組織標(biāo)本的固定，尤其用于電鏡超薄切片的小組織塊標(biāo)本的初固定。第25頁/共61頁常用混合固定液：種類很多?？筛鶕?jù)檢查目的不同選擇不同的

16、固定液。 1. Zenker固定液：重鉻酸鉀 2.5 g升汞 （氯化高汞，HgCl2） 5 g蒸餾水 100 ml冰醋酸（臨用時(shí)加入） 5 ml第26頁/共61頁配制方法：首先將重鉻酸鉀、升汞和蒸餾水混合后加溫溶解，冷卻后過濾，置于棕色玻璃瓶中避光保存，這種配制的液體一般稱為Zenker氏干液（儲(chǔ)存液、底液）。此液較為穩(wěn)定，即使配制12年后仍有固定作用，待組織取材時(shí)則在Zenker干液100ml中加入5ml冰醋酸即可使用，但加入冰醋酸后必須立即使用，否則失去固定作用。特點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞核、胞漿染色均較清晰，也較穩(wěn)定，對(duì)肌組織及結(jié)締組織染色效果好。材料厚度不超過2 mm 固定34小時(shí)即可，一般固定為1

17、224小時(shí)。但必須經(jīng)流水洗1224小時(shí)后再經(jīng)酒精脫水。第27頁/共61頁2Carnoy固定液純酒精（或者95） 6份氯 仿 3份冰醋酸 1份優(yōu)點(diǎn)：此液穿透速度快，小塊組織l2小時(shí)即可。此固定液可固定細(xì)胞漿及糖原。冰醋酸對(duì)染色質(zhì)有固定作用，同時(shí)能抵消由于酒精引起的過度收縮與硬化。為了減少組織的收縮，可采用冷Carnoy液。Carnoy液隨組織一起放置冰箱中固定一般固定時(shí)間以不超過1218小時(shí)為好。經(jīng)此液固定的組織可直接入95或者100酒精脫水，現(xiàn)用現(xiàn)配為佳。它既可以用于一般組織學(xué)固定，可為組織化學(xué)常用固定劑，特別是用于糖原、DNA和RNA的固定。第28頁/共61頁組織固定方法1. 原位固定法在動(dòng)

18、物活體情況下，采用快速邊取材邊滴加固定液，取出標(biāo)本后再浸泡固定30min-1h，這樣有益于組織結(jié)構(gòu)的保存，以上操作應(yīng)在0-4下進(jìn)行。2. 浸透固定法預(yù)先冷藏固定液0-4，固定液量應(yīng)是樣品4040倍以上，浸泡30-90min30-90min或更長(zhǎng)，應(yīng)根據(jù)組織和固定液的不同而定。3.培養(yǎng)細(xì)胞和涂片固定法單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶只需將培養(yǎng)內(nèi)蓋片取出浸透固定即可。懸液培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)離心濃縮后涂片，或離心管內(nèi)加入固定液2000r/min約20 min離心成團(tuán)后制作切片。也可以向離心管內(nèi)加入膠凍再離心，切取離心管尖端膠凍固定。第29頁/共61頁4. 灌注固定法通過心血管途徑將固定劑灌注到全身或某一器官，使生活的細(xì)胞在原

19、位迅速固定后再取材，可達(dá)到非常好的固定效果，尤其對(duì)于腦等需要很長(zhǎng)取材時(shí)間的器官更有意義。麻醉或頸椎脫臼處死動(dòng)物后，立即打開胸腹腔和心包，滴溜注射針刺入左心室或主動(dòng)脈內(nèi)，剪開右心耳排血，立即用含有適量肝素的生理鹽水或緩沖液灌注，清洗血液；然后很快用固定液繼續(xù)灌注，灌注量及灌注壓應(yīng)根據(jù)灌注血管不同而定，大小鼠心灌注時(shí)其壓力約為100-150mmHg，灌流量約為5-10ml/min，灌注時(shí)間一般在5-20min左右，一般以觀察動(dòng)物肝質(zhì)地變硬為準(zhǔn)。灌注固定完成后（也可用緩沖液繼續(xù)灌注清除固定劑）取材，并可用固定液后固定2小時(shí)。灌注固定快速均勻， 可保存細(xì)胞組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)，但必須掌握操作技術(shù)才可能達(dá)到固

20、定目的。第30頁/共61頁三、水洗用水道流水洗滌，目的是將組織塊中的固定液取代出來，水洗一定要充分。水洗時(shí)間數(shù)小時(shí)至24小時(shí)。根據(jù)材料多少、大小可靈活掌握水洗工具，可用水洗筐或用紗布包裹，要防止水流大將組織塊沖掉或丟失?？蒲杏眯〔牧弦部捎肞BS液多次浸泡洗滌，但要保證至少4-6小時(shí)的洗滌時(shí)間。第31頁/共61頁四、脫水組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化，但達(dá)不到切薄片的硬度，必須進(jìn)行除固定液以外的其它處理，脫水就是繼固定后的重要步驟。經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水份，在這種情況下首先必須除去組織內(nèi)部的水份，這種除水的過程叫做脫水，脫水使用的藥劑稱為脫水劑。脫水必須逐漸依次從低濃度酒精開始到高濃度酒精，否則

21、會(huì)引起組織強(qiáng)烈收縮變脆，不利制片，但脫水不徹底也很難浸蠟。第32頁/共61頁常用脫水劑：酒精、丙酮、正丁醇等。1. 酒精一股是從70酒精開始，經(jīng)809095100I一100II，每步驟脫水時(shí)間根據(jù)材料大小而靈活掌握，一般數(shù)小時(shí)到12小時(shí)，更換一次酒精。無水乙醇不適合用來配低濃度酒精，價(jià)格較貴。取95酒精70ml加蒸餾水25ml，配成70酒精95ml。80酒精取95酒精80ml加蒸餾水至95ml即可，依次類推。2. 丙酮脫水作用與酒精相似，雖然其脫水作用比酒精強(qiáng)，但對(duì)組織塊的收縮較嚴(yán)重，且價(jià)錢較貴，故不宜用于一股組織脫水。丙酮既有脫水作用，又有透明作用。用丙酮固定的材料要小，脫水1一8小時(shí)即可。

22、 第33頁/共61頁五、透明 組織塊脫水后需要透明，因?yàn)樗c蠟不能相交換，需要借助石蠟誘導(dǎo)劑的過渡。石蠟誘導(dǎo)劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài)，習(xí)慣上將石蠟誘導(dǎo)劑滲入組織內(nèi)的過程叫透明，而這種藥劑稱為透明劑。透明的時(shí)間依組織塊的大小而定，一般采用20分鐘至1小時(shí)左右，如組織塊過大可延長(zhǎng)透明時(shí)間，透明好的材料如同油炸的感覺，呈透明狀。 第34頁/共61頁最常用的透明劑為二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。二甲苯：是無色透明的一種有機(jī)溶媒，有很強(qiáng)的刺激氣味，易揮發(fā)，長(zhǎng)期接觸對(duì)粘膜有刺激作用。二甲苯透明組織的作用很強(qiáng)，可使組織收縮變形，故透明時(shí)間不宜過長(zhǎng)。透明過程中如遇到組織塊內(nèi)部或某一個(gè)部位呈白色混濁狀態(tài)

23、時(shí)，說明脫水不徹底，進(jìn)而造成透明不徹底，無法下一步浸蠟。應(yīng)退回到100酒精中重新徹底脫水。第35頁/共61頁六、浸蠟與包理 浸蠟的目的是為了能制備一菲薄的切片做準(zhǔn)備。將透明好的組織塊浸到石蠟中，使石蠟滲透到組織細(xì)胞內(nèi)，將組織細(xì)胞內(nèi)的二甲苯完全徹底地取代出來，然后再用石蠟將組織包埋起來，冷卻后，切成小塊，修整好切面，再用切片機(jī)切極薄的切片，將這一過程稱為浸蠟與包埋。第36頁/共61頁蠟的種類：主要有兩類： 蜂蠟：是動(dòng)物體內(nèi)提取的蠟，顏色微黃，故也稱為黃蠟，溶點(diǎn)在54左右。特點(diǎn)是潤(rùn)滑帶有粘性，冬天用量比夏天多。 石蠟：是由礦物質(zhì)中提取，質(zhì)地較疏松，色白。根據(jù)蠟的溶點(diǎn)不同又可分為軟蠟及硬蠟： 溶點(diǎn)在

24、50以下的石蠟稱為軟蠟。溶點(diǎn)在50以上的石蠟稱為硬蠟。兩種蠟可以摻合在一起使用（沒條件的情況下可用蠟燭來代替）。上海生物制品廠出的石蠟熔點(diǎn)有5254，5658，5860，6062這幾種。第37頁/共61頁具體操作：1. 浸蠟將石蠟箱溫調(diào)至5 860左右，內(nèi)有標(biāo)明I、II、III等字樣的蠟杯或蠟缸。組織塊從透明的二甲苯II取出之后，本身帶有少量二甲苯，放入I號(hào)蠟杯中23小時(shí)左右，再將組織塊移入II號(hào)蠟杯（純蠟）24小時(shí)，最后移入III號(hào)蠟杯中（純蠟）半天或者稍降蠟箱溫度過夜。注意：浸蠟時(shí)蠟杯不要顛倒順序，以免脫苯不徹底。 如遇特殊情況需要延長(zhǎng)浸蠟時(shí)間時(shí)可降低蠟箱溫度或關(guān)閉蠟箱需要時(shí)再開。溫度越高

25、、時(shí)間越長(zhǎng)，組織塊收縮越嚴(yán)重，而且材料脆，不易切片。第38頁/共61頁2 . 包埋：包埋的方法多種，最常用的是石蠟包埋法。除此之外還有火棉膠包埋法、炭蠟包埋法、明膠包埋法及環(huán)氧樹脂包埋法（電鏡用）。冰凍切片采用水包埋法或特殊專用包埋劑包埋等。包埋時(shí)用純石蠟溶解后（60）倒入包埋框內(nèi)或者用紙盒代替也可，迅速將浸好的組織塊依次擺入框內(nèi)，待蠟逐漸冷卻凝固后就將組織材料一并凝結(jié)在石蠟內(nèi)。然后按大小組織塊切成蠟塊，組織四周蠟邊留0.1厘米左右即可。包埋時(shí)組織塊的切面向下、放平。如果操作不熟練或在冬天包埋時(shí)最好有一酒精燈，在材料包入石蠟之前稍在酒精燈上過一下（稍加一下溫），以免材料與包埋蠟溫度不符造成材料

26、與包埋蠟有一痕跡，切片時(shí)產(chǎn)生分離現(xiàn)象。蠟塊上要燙上標(biāo)記年號(hào)例號(hào)等字樣的紙片以長(zhǎng)期保存，切完的蠟塊表面要用燙片板燙一下，封閉材料面，隔離空氣接觸，可長(zhǎng)期保存材料不干。目前主要用不同規(guī)格的包埋框包埋材料，在包埋機(jī)上操作，方便、快捷。第39頁/共61頁七、切片載玻片的準(zhǔn)備、粘附劑的使用：. .商品化準(zhǔn)備好的載玻片：兩端帶有“”標(biāo)志，無須處理，直接使用；比較昂貴；. .常規(guī)載玻皮的處理：鉻硫酸浸泡2424小時(shí)，流水沖洗1212小時(shí)，蒸餾水洗3 3遍，烘干，備用；玻片較干凈時(shí)，也可用稀鹽酸浸泡。 蛋白甘油：用雞蛋清（不要雞蛋黃）用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬笥脭?shù)層紗布過濾后加等量的甘油攪均勻加數(shù)顆麝香草酚（防腐）。

27、載玻片上薄層涂抹后晾干，備用。主要用于常規(guī)組織學(xué)、組織化學(xué)染色用。 第40頁/共61頁多聚賴氨酸（poly-L-lycine, PLLpoly-L-lycine, PLL） 多聚賴氨酸（M.W=300kDM.W=300kD） 0.5g0.5g 蒸餾水 100ml100ml配制方法：稱取多聚賴氨酸，配制0.5%0.5%的水溶液，充分混合即可。也可適當(dāng)稀釋配成0.01%-0.01%-0.5%0.5%濃度。44保存，也可在-20-20備用。多聚賴氨酸可反復(fù)冰凍，效果無大影響。工作液常用稀釋10-5010-50倍。主要用于免疫組織化學(xué)、原位雜交、TUNELTUNEL染色等。第41頁/共61頁APESA

28、PES粘片劑（VectabongVectabong試劑）（3-Amino propyltriethoxy silane3-Amino propyltriethoxy silane）是一種新型玻片粘附劑，通過對(duì)玻璃表面的化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地粘貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時(shí)間較久。一個(gè)試劑盒7ml7ml可配成350ml350ml（丙酮）工作液。 程序：干凈載玻片丙酮5min APES(1ml+50ml5min APES(1ml+50ml丙酮），將玻片用鑷子夾住浸入APESAPES試劑1-21-2次純丙酮洗2 2次干燥，3737過夜用鋁箔包好，RTRT存放，

29、備用。鉻礬明膠液（略）甲醛- -明膠液（略）注意：備用載玻片均要避免污染（尤其注意防塵）； 一般可保存半年以上。第42頁/共61頁制作切片需要的工具：切片刀、磨切機(jī)、水浴鍋、干燥箱或烤片機(jī)（可用蠟箱代替使用）。還需載玻片、手術(shù)刀、毛筆一支、彎鑷子一個(gè)、托盤一個(gè)、大平皿一個(gè)、（展片使用）烤片盒或烤片架、蛋白甘油等。切片機(jī)：1. 切片機(jī)種類：有輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，滑行式切片機(jī)（滑動(dòng)式），冰凍切片機(jī)，超薄切片機(jī)（電鏡用）等；2. 構(gòu)造：任何一個(gè)類型的切片機(jī)都是由四個(gè)基本部分組成：刀臺(tái)；標(biāo)本臺(tái)；旋轉(zhuǎn)輪；控制切片厚度的微動(dòng)裝置（標(biāo)有 l25或1一50的數(shù)字，每一數(shù)字代表一個(gè)微米用來顯示）?？筛鶕?jù)需要厚度來調(diào)節(jié)

30、，一般組織片都采用7。以上四部分共裝在一個(gè)鐵制的臺(tái)坐上，這樣就組成了各種類型的切片機(jī)，最常用的是石蠟切片機(jī)。第43頁/共61頁切片操作：將切割修整好的蠟塊用普通刀片先將蠟塊切面暴露出來、修平，固定在切片機(jī)標(biāo)本臺(tái)上并擰緊螺旋。切片刀固定于刀臺(tái)上，擰緊固定刀的螺絲，同時(shí)調(diào)整刀與蠟塊的切片距離，使刀與蠟塊貼緊后再固定刀臺(tái)螺絲，刀的角度為25度角。調(diào)節(jié)微動(dòng)裝置，調(diào)至切片所需厚度（一般為 6-7微米）修材。右手握旋轉(zhuǎn)輪搖把，按順時(shí)針方向均勻地?fù)u動(dòng)直到組織塊切面完整為止。如果以上各部操作正常，此時(shí)能切出一條完整的連續(xù)的蠟帶，用毛筆輕輕將蠟帶順刀口挑下，放在托盤內(nèi)待用。第44頁/共61頁水浴鍋展片、撈片通電

31、后將平皿內(nèi)水溫升至45左右，將已切好的薄片切割數(shù)片輕漂水中展平，不平時(shí)可用小彎鑷子輕輕展平，然后用涂有蛋白甘油等粘附劑的載片在水中選擇完整的切片以一定角度進(jìn)行撈片。注意事項(xiàng)： 1切片刀要鋒利，否則切片有切痕或組織破碎，甚至切不下來。2展切片時(shí)水溫要適當(dāng)，水溫低展不平切片，影響效果，有皺折；水溫過高切片入水后蠟片及組織熔化。第45頁/共61頁八、染色 染色前準(zhǔn)備工作染色用的工具：12個(gè)染色缸或者盛各種不同濃度的酒精染色筐廣口瓶，染色缸及脫蠟、透明用的各二個(gè)二甲苯缸，蓋片，帶磨口蓋的樹膠瓶一個(gè)，鑷子等。第46頁/共61頁染色需要的試劑及染色液的配制：鹽酸酒精：主要是染色分色時(shí)用。一般采用0. 51

32、的濃度，即在100ml的7080酒精中加人0.5或者1ml的濃鹽酸。 蘇木素（Hematoxylin）蘇木素為細(xì)胞核的染料，不經(jīng)氧化的蘇木素是不具有染色能力的。蘇木素的配方很多，一般組織化學(xué)染色所配制的蘇木素有二類：一類是自然氧化的蘇木素，另一類是加入氧化劑加速氧化的蘇木素。 伊紅（曙紅， Eosin）是細(xì)胞質(zhì)最常用的染料之一。外觀是紅色粉末。分兩種，一種是酒溶性伊紅，另一種為水溶性伊紅。使用前要看說明以免配錯(cuò)。一般組織病理學(xué)切片染色，染細(xì)胞核用蘇木素，染細(xì)胞質(zhì)用伊紅，故稱之為HE染色（蘇木素-伊紅染色法），是諸多染色法的最基本染色法之一。第47頁/共61頁蘇木素的配方：自然氧化Ehrlieh

33、氏蘇木素 蘇木精 2g 銨明礬 3g 無水酒精 100ml 甘油 100ml 蒸餾水 100ml將上述藥品配在一起后裝入玻璃瓶中，敞口罩上數(shù)層紗布以防灰塵落入染液，暴露于陽光中或空氣中自然氧化（此過程也稱為成熟），時(shí)間約68周以上，染液配制越久其染色能力越強(qiáng)，這種配方一次可以大量配制以備用。 第48頁/共61頁DelafieldDelafield氏蘇木素 蘇木素 4g4g 無水酒精 25ml 25ml 銨明礬飽和水溶液 400ml400ml銨明礬飽和水溶液有兩種配法，一為1010銨明礬水溶液，另一為1 1份銨明礬加蒸餾水1111份。蘇木精溶入酒精后，加入銨明礬液，倒入玻璃瓶中敞開瓶口，罩以數(shù)層

34、紗布，置光線充足處3 3至5 5天過濾。再加入甘油100ml100ml、甲醇100ml100ml，再置光線充足處經(jīng)l l個(gè)半月至兩個(gè)月后成熟。此液可保存多年不壞。染色時(shí)多采用蒸餾水稀釋的染色液。 第49頁/共61頁加氧化劑的蘇木素配方-Harris-Harris氏蘇木素 液 蘇木精 lglg 無水酒精 10ml10ml 液 鉀（銨）明礬 20g20g 蒸餾水 200ml200ml先將用玻璃棒攪拌使蘇木素溶解，再將液煮沸溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化汞0.5g0.5g，再煮沸迅速冷卻后加入冰醋酸8ml,8ml,過濾使用，此液為組織病理學(xué)常用染色液。 第50頁/共61頁伊紅染

35、液的配制（Eosin）配法： 0.5水溶性伊紅取伊紅0.5g加蒸餾水100ml即可，待徹底溶解后使用。 0.5酒溶性伊紅取伊紅0.5g加70酒精100ml即可，待徹底溶解后使用。 第51頁/共61頁染色方法及步驟（以HE染色為例） 1脫蠟，將干燥的切片入二甲苯I 10-20分鐘，然后移入二甲苯 10-20分鐘。2脫苯：用無水乙醇I 脫苯2-5分鐘，再經(jīng)無水乙醇II 2-5分鐘。3水化：再經(jīng)95908070酒精各1分鐘，入蒸餾水浸洗數(shù)分鐘，每步操作要輕。4染細(xì)胞核，將切片移入蘇木素染液中染10-20分鐘。5水洗（水洗一下，將浮在表面的染液去掉）。6l鹽酸酒精分化，時(shí)間幾秒鐘，肉眼觀察切片組織材料

36、呈粉紅色即可。第52頁/共61頁7 7蘭化：水道流水洗（半小時(shí)-24-24小時(shí)），切片從粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r艷的蘭色，這過程也稱為蘭化的過程。必要時(shí)放入氨水的低堿液中浸幾分鐘。8 8染細(xì)胞質(zhì)：用0.50.5或者l l伊紅水溶液進(jìn)行染色，1-51-5分鐘。9 9切片脫水：是由低濃度酒精到高濃度酒精。將切片入7070808090909595酒精，時(shí)間幾秒鐘，時(shí)間長(zhǎng)了，伊紅易脫色，注意伊紅與蘇木素的對(duì)比染色的色調(diào)適合。1010徹底脫水，100100酒精I(xiàn) 510I 510分鐘，再入100100IIII酒精 510510分鐘。11. 11. 透明：入二甲苯I 25I 25分鐘，再入二甲苯II 25II 25分鐘。第53頁/共61頁用中性樹膠進(jìn)行封固。細(xì)胞核經(jīng)蘇木素染成鮮艷的蘭色，細(xì)胞質(zhì)、核仁、肌纖維、膠原纖維、紅細(xì)胞等呈紅色。HE染色程序：二甲苯I二甲苯II （脫蠟） 無水酒精I(xiàn)無水酒精I(xiàn)I95908070水洗染蘇木素（染細(xì)胞核）（10一20分鐘）自來水洗1鹽酸酒精分化自來水洗