核酸化學(xué)2DNA的結(jié)構(gòu)和特性

1、會計學(xué)1核酸化學(xué)核酸化學(xué)2DNA的結(jié)構(gòu)和特性的結(jié)構(gòu)和特性第1頁/共106頁第2頁/共106頁雙螺旋分子中糖分子與縱軸雙螺旋分子中糖分子與縱軸平行，與堿基平面垂直。平行，與堿基平面垂直。穩(wěn)定雙螺旋穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵和力為氫鍵和堿基堆積力堿基堆積力（即疏水作（即疏水作用）。用）。第3頁/共106頁第4頁/共106頁DNA的大?。旱拇笮。菏删w噬菌體T2DNA長約長約50 mE-coli DNA 長約長約1 mm人生殖細(xì)胞人生殖細(xì)胞DNA長約長約1 m第5頁/共106頁第6頁/共106頁共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,

2、 cccDNA）的）的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)（superhelical structure） 形成超螺旋的基礎(chǔ)形成超螺旋的基礎(chǔ): : DNA雙螺旋的扭雙螺旋的扭曲形成超螺旋曲形成超螺旋（superhelix） 超螺旋超螺旋：指雙螺旋環(huán)狀：指雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化即成為分子再度螺旋化即成為超螺旋結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)。第7頁/共106頁自從自從1965年年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的毒的環(huán)形環(huán)形DNA的超螺旋的超螺旋以來，現(xiàn)已知道絕以來，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物的大多數(shù)原核生物的DNA都是都是共價（封）閉共價（封）閉環(huán)環(huán)（covalently closed circle, 簡稱簡稱

3、cccDNA 分子）。分子）。對于真核生物來說，雖然其染色體上對于真核生物來說，雖然其染色體上多為線形多為線形DNA分子，但其分子，但其DNA均與蛋白質(zhì)均與蛋白質(zhì)結(jié)合，兩個結(jié)合，兩個結(jié)合點之間的結(jié)合點之間的DNA形成類似形成類似CCC分子的環(huán)結(jié)構(gòu)分子的環(huán)結(jié)構(gòu)（loop），同樣具有超），同樣具有超螺旋形成。螺旋形成。第8頁/共106頁拓樸學(xué)拓樸學(xué)（topology）是專門研究物體）是專門研究物體變形后仍然保留下來的結(jié)構(gòu)特性。變形后仍然保留下來的結(jié)構(gòu)特性。第9頁/共106頁第10頁/共106頁 噬菌體噬菌體DNA在不同的生活周期可以以在不同的生活周期可以以環(huán)形環(huán)形或或線線形形存在，線狀存在，線狀D

4、NA的兩端有粘末端（的兩端有粘末端（cos位點，位點，cohensive-end site），有助于），有助于DNA連接酶將互補(bǔ)的連接酶將互補(bǔ)的粘末端連成環(huán)狀。其中會帶來拓樸學(xué)的問題。粘末端連成環(huán)狀。其中會帶來拓樸學(xué)的問題。一段長一段長260 bp的的B-DNA，周期數(shù)為周期數(shù)為25，把它們連接成環(huán)，此時的，把它們連接成環(huán)，此時的DNA為為松弛型松弛型DNA。若將上述。若將上述DNA先先擰松擰松2周后再連接成環(huán)周后再連接成環(huán)，可以形成兩種環(huán)形，可以形成兩種環(huán)形DNA，一種稱，一種稱解鏈環(huán)形解鏈環(huán)形DNA（螺旋周數(shù)（螺旋周數(shù)23）和）和突環(huán)突環(huán)。另一種為。另一種為超螺旋超螺旋DNA，螺周數(shù)仍為螺

5、周數(shù)仍為25，但同時具有，但同時具有2個個超螺旋周超螺旋周。從力能學(xué)看，超螺旋更易形成。超螺旋。從力能學(xué)看，超螺旋更易形成。超螺旋DNA具有更為致密的結(jié)構(gòu)，可以將具有更為致密的結(jié)構(gòu)，可以將很長的很長的DNA分子壓縮在一個較小的體積。分子壓縮在一個較小的體積。生物體的生物體的DNA絕大多數(shù)是以超螺旋形式存在的。超螺旋絕大多數(shù)是以超螺旋形式存在的。超螺旋DNA密度較大，離密度較大，離心場中較線形或開環(huán)心場中較線形或開環(huán)DNA移動快，凝膠電泳時泳動的速度也較快。移動快，凝膠電泳時泳動的速度也較快。DNA拓?fù)洚悩?gòu)體之間的轉(zhuǎn)變是通過拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)體之間的轉(zhuǎn)變是通過拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomeras

6、e)來實現(xiàn)的。來實現(xiàn)的。第11頁/共106頁圖圖 2420 bp環(huán)形雙股DNA，形成42匝螺旋。切開后旋松6圈后再連成環(huán)狀，會形成兩種構(gòu)象結(jié)構(gòu)。第12頁/共106頁 超螺旋超螺旋DNA可采取兩種拓?fù)鋵W(xué)可采取兩種拓?fù)鋵W(xué)上相當(dāng)?shù)男问?。一種相當(dāng)于上相當(dāng)?shù)男问?。一種相當(dāng)于雙螺旋雙螺旋繞圓柱體旋轉(zhuǎn)繞圓柱體旋轉(zhuǎn)；另一種相當(dāng)于；另一種相當(dāng)于雙螺雙螺旋相互盤繞旋相互盤繞。超螺旋的這兩種形式。超螺旋的這兩種形式可以相互轉(zhuǎn)變。可以相互轉(zhuǎn)變。第13頁/共106頁圖圖 3第14頁/共106頁 DNA結(jié)構(gòu)的上述變化可以用數(shù)學(xué)式來結(jié)構(gòu)的上述變化可以用數(shù)學(xué)式來表述：表述：L = T W L稱為稱為DNA的連接數(shù)的連接數(shù)，它

7、是，它是DNA的一股鏈繞另一的一股鏈繞另一股鏈盤繞的次數(shù)，它代表環(huán)型雙螺旋股鏈盤繞的次數(shù)，它代表環(huán)型雙螺旋DNA分子的拓?fù)浞肿拥耐負(fù)涮匦?。在不發(fā)生鏈的斷裂時特性。在不發(fā)生鏈的斷裂時, 它是一常數(shù)。例如，前圖它是一常數(shù)。例如，前圖中中DNA原來的原來的L為為42，放松后為，放松后為36。在右手雙螺旋中，。在右手雙螺旋中，L規(guī)定為正。規(guī)定為正。T稱為盤繞數(shù)稱為盤繞數(shù)，它代表，它代表DNA的一股鏈繞雙螺旋軸所的一股鏈繞雙螺旋軸所做的完整的旋轉(zhuǎn)數(shù)。對做的完整的旋轉(zhuǎn)數(shù)。對B-DNA而言，它等于而言，它等于DN A的堿的堿基數(shù)除以基數(shù)除以10（晶體中）。（晶體中）。W為超盤繞數(shù)為超盤繞數(shù)，代表雙螺旋軸，代

8、表雙螺旋軸在空間的轉(zhuǎn)動數(shù)，在空間的轉(zhuǎn)動數(shù)，T和和W是可變的是可變的。第15頁/共106頁 前圖中，其中原來的環(huán)型前圖中，其中原來的環(huán)型DNA的的L=42，T=42，故，故W=0，即不存在，即不存在超螺旋。它螺旋軸處在同一平面中超螺旋。它螺旋軸處在同一平面中，分子處于松弛狀態(tài)。在保留一單，分子處于松弛狀態(tài)。在保留一單鏈區(qū)的鏈區(qū)的DNA分子中，分子中，L和和T都為都為36，分子仍未形成超螺旋。在超螺旋分子仍未形成超螺旋。在超螺旋DNA中，中，L仍為仍為36，若使，若使T保持未松保持未松開前的開前的42，W就成就成-6，即成為超，即成為超盤繞盤繞 6次的負(fù)超螺旋次的負(fù)超螺旋。第16頁/共106頁超螺

9、旋是超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的一種普遍形式。三級結(jié)構(gòu)的一種普遍形式。雙雙螺旋螺旋DNA的松開導(dǎo)致形成負(fù)超螺旋的松開導(dǎo)致形成負(fù)超螺旋，而，而DNA的的擰緊則導(dǎo)致形成正超螺旋擰緊則導(dǎo)致形成正超螺旋。 天然的天然的DNA都呈負(fù)超螺旋都呈負(fù)超螺旋，但在，但在體外可得正超體外可得正超螺旋螺旋。溴乙錠、放線菌素。溴乙錠、放線菌素D等的分子都是扁平的等的分子都是扁平的，它們可以嵌入，它們可以嵌入DNA的堿基對之間。溴乙錠分的堿基對之間。溴乙錠分子的嵌入能使相鄰堿基對的間隔增至子的嵌入能使相鄰堿基對的間隔增至0.7 nm。對。對一個呈負(fù)超螺旋的環(huán)形一個呈負(fù)超螺旋的環(huán)形DNA分子來說，溴乙錠分子來說，溴乙錠的嵌人

10、并沒有改變連接數(shù)，但盤繞數(shù)減少，結(jié)果的嵌人并沒有改變連接數(shù)，但盤繞數(shù)減少，結(jié)果超螺旋數(shù)向相反方向改變。隨著溴乙錠量的增加超螺旋數(shù)向相反方向改變。隨著溴乙錠量的增加，負(fù)超螺旋，負(fù)超螺旋DNA就轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙趹B(tài)；溴乙錠的再就轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙趹B(tài)；溴乙錠的再進(jìn)一步增加，進(jìn)一步增加，DNA就轉(zhuǎn)變?yōu)檎菪?。就轉(zhuǎn)變?yōu)檎菪５?7頁/共106頁第18頁/共106頁Gyrase：促旋酶，旋轉(zhuǎn)酶：促旋酶，旋轉(zhuǎn)酶Topoisomerase：拓?fù)洚悩?gòu)酶：拓?fù)洚悩?gòu)酶第19頁/共106頁DNA雙螺旋為右旋螺旋。細(xì)雙螺旋為右旋螺旋。細(xì)胞中的胞中的環(huán)狀環(huán)狀DNA一般呈一般呈負(fù)超負(fù)超螺旋螺旋，即右旋螺旋不足導(dǎo)致，即右旋螺旋不足導(dǎo)致

11、部分堿基不形成配對，分子部分堿基不形成配對，分子通過整體拓?fù)鋵W(xué)上的右旋來通過整體拓?fù)鋵W(xué)上的右旋來補(bǔ)足右旋螺旋的不足，在數(shù)補(bǔ)足右旋螺旋的不足，在數(shù)學(xué)上呈學(xué)上呈1：1，即分子整體右，即分子整體右旋一圈來補(bǔ)雙螺旋上的一圈旋一圈來補(bǔ)雙螺旋上的一圈不足。不足。正超螺旋為正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度，通過分子整體的左旋來解，通過分子整體的左旋來解去過度的螺旋去過度的螺旋。第20頁/共106頁為了說明超螺旋的方向，我們可以用為了說明超螺旋的方向，我們可以用一根細(xì)繩做實驗，假設(shè)一根細(xì)繩做實驗，假設(shè)原來的繩子兩股以原來的繩子兩股以右旋方向纏繞右旋方向纏繞。如果在一端。如果在一端使繩子向緊纏使繩子向緊纏

12、的方向的方向（overwinding）捻轉(zhuǎn)捻轉(zhuǎn)，再將繩子兩，再將繩子兩端連接起來，則會產(chǎn)生一個端連接起來，則會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋左旋的超螺旋以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超，這樣的超螺旋叫做螺旋叫做正超螺旋正超螺旋。相反如果在繩子一端。相反如果在繩子一端向松纏方向（向松纏方向（underwinding）捻轉(zhuǎn)，再將）捻轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來，則會產(chǎn)生一個右旋的繩子兩端連接起來，則會產(chǎn)生一個右旋的超螺旋以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變，這超螺旋以解除外加的捻轉(zhuǎn)造成的脅變，這種超螺旋叫做種超螺旋叫做負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋。第21頁/共106頁（1）對于右手螺旋的）對于右手螺旋的

13、DNA分子來說，當(dāng)處于分子來說，當(dāng)處于B-DNA構(gòu)型時，一般每轉(zhuǎn)一圈有構(gòu)型時，一般每轉(zhuǎn)一圈有10.5個核苷酸對，雙螺旋處于個核苷酸對，雙螺旋處于能力學(xué)上最穩(wěn)定狀態(tài)，稱為能力學(xué)上最穩(wěn)定狀態(tài)，稱為松弛（松弛（relaxed）狀態(tài)）狀態(tài)（雙（雙螺旋軸沒有螺旋軸沒有“凈彎曲纏繞凈彎曲纏繞”）。）。（2）如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)）如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)少于少于10.5，則其二，則其二級結(jié)構(gòu)處于級結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)緊纏狀態(tài)，由此而產(chǎn)生的超螺旋是，由此而產(chǎn)生的超螺旋是正正超螺旋。超螺旋。（3）如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)）如果每圈初級螺旋的堿基對數(shù)多于多于10.5，則其二，則其二級結(jié)構(gòu)處于級結(jié)構(gòu)處于松纏狀

14、態(tài)松纏狀態(tài)，由此而產(chǎn)生的超螺旋是，由此而產(chǎn)生的超螺旋是負(fù)負(fù)超螺旋超螺旋。 因此，因此，超螺旋總是要向著抵消初級螺旋改變的方向發(fā)超螺旋總是要向著抵消初級螺旋改變的方向發(fā)展展；雙螺旋雙螺旋DNA的松開導(dǎo)致形成負(fù)超螺旋的松開導(dǎo)致形成負(fù)超螺旋；而；而DNA的的擰緊，則導(dǎo)致形成正超螺旋擰緊，則導(dǎo)致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛；所有的超螺旋都比松弛型含有更多的自由能。型含有更多的自由能。第22頁/共106頁松弛型，松弛型，OC, Open circular DNA超螺旋超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNALinear DNA從細(xì)菌抽提得到從細(xì)菌抽提得到的質(zhì)

15、粒的質(zhì)粒DNA 樣樣品中不含線狀品中不含線狀DNA第23頁/共106頁電電泳泳方方向向第24頁/共106頁平均每平均每200bp的的DNA繞核小繞核小體左旋體左旋1.75轉(zhuǎn)，因此真核生轉(zhuǎn)，因此真核生物的物的DNA分子為正超螺旋分子為正超螺旋第25頁/共106頁第26頁/共106頁 大多數(shù)大多數(shù)DNA的的超螺旋密度約為超螺旋密度約為-0.05，這相，這相當(dāng)于當(dāng)于每每200bp存在存在1負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋。DNA的超螺旋水的超螺旋水平在活體中是重要的，但它并不是在整個平在活體中是重要的，但它并不是在整個DNA分子中都是均勻的。分子中都是均勻的。DNA特定區(qū)域中超螺旋的特定區(qū)域中超螺旋的增加有助于增加

16、有助于DNA的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。DNA結(jié)構(gòu)變化結(jié)構(gòu)變化之一就是使之一就是使DNA雙股鏈分開雙股鏈分開，或，或局部熔解局部熔解。超。超螺旋所具有的多余的能量被用于堿基間氫鍵的螺旋所具有的多余的能量被用于堿基間氫鍵的斷裂。斷裂。DNA中，中，10bp的分離大約需的分離大約需 50-209 kJ/mol，因此，因此，DNA所具有超螺旋水平僅是分所具有超螺旋水平僅是分離很少幾個堿基對，但離很少幾個堿基對，但DNA的這種結(jié)構(gòu)上的變的這種結(jié)構(gòu)上的變化化對復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等的啟動仍很重要對復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等的啟動仍很重要。第27頁/共106頁第28頁/共106頁第29頁/共106頁分離核酸的一般原則分離核酸的一般原

17、則 因為遺傳信息全部貯存在核酸的一因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結(jié)構(gòu)中，故級結(jié)構(gòu)中，故完整的一級結(jié)構(gòu)完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。核酸的分離和純化時應(yīng)遵循兩個原則：核酸的分離和純化時應(yīng)遵循兩個原則： 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性-完整完整； 排除其它分子的污染排除其它分子的污染-純純。第30頁/共106頁核酸的純度要求核酸的純度要求 核酸樣品中核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作不應(yīng)存在對酶有抑制作用的用的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑和和過高濃度的過高濃度的金屬離子金屬離子； 其它生物大分子如其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)、多糖和脂脂類

18、分子的類分子的污染應(yīng)降低到最低程度污染應(yīng)降低到最低程度； 排除排除其它核酸分子其它核酸分子的污染的污染，如提取，如提取DNA分子時應(yīng)去除分子時應(yīng)去除RNA，反之亦然。，反之亦然。第31頁/共106頁核酸分離純化的注意事項核酸分離純化的注意事項 盡量盡量簡化操作步驟簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；害因素對核酸的破壞； 減少化學(xué)物質(zhì)對核酸的降解減少化學(xué)物質(zhì)對核酸的降解，為避免過酸、過堿對，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH410條件下條件下進(jìn)行；進(jìn)行； 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降

19、解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中。其中DNA酶酶需要金屬二價陽離子需要金屬二價陽離子Mg2+、Ca2+的激活的激活，因此使用，因此使用金屬離子螯合劑金屬離子螯合劑，如，如EDTA或檸檬酸鹽等基或檸檬酸鹽等基本上可以抑制本上可以抑制DNA酶的活性。而酶的活性。而RNA酶酶不但不但分布廣泛分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所，所以生物降解是以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；提取過程中的主要危害因素； 第

20、32頁/共106頁 減少減少物理因素物理因素對核酸的降解對核酸的降解，物理降解因素，物理降解因素主要是主要是機(jī)械剪切力機(jī)械剪切力，其次是，其次是高溫高溫。機(jī)械剪切力機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式的破拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式的破裂及裂及DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實驗操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要實驗操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對象是危害對象是大分子量的線性大分子量的線性DNA分子分子，如真核，如真核細(xì)胞的染色體細(xì)胞的染色體DNA等。等。高溫高溫，如長時間煮

21、沸，如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為程中常規(guī)操作溫度為04以降低核酸酶的活以降低核酸酶的活性從而減少對核酸的生物降解。性從而減少對核酸的生物降解。第33頁/共106頁核酸分離純化的一般步驟核酸分離純化的一般步驟 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子分子沉淀核酸沉淀核酸去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)純化干燥純化干燥溶解。溶解。 核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待核酸提取方案，

22、應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點而定。對于某特定細(xì)胞器提取核酸分子的特點而定。對于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。 第34頁/共106頁 真核真核DNA以以核蛋白核蛋白（DNP）形）形式存在，式存在，DNP溶于水或高鹽溶液溶于水或高鹽溶液（1 mol/L NaCl），但不溶于低），但不溶于低鹽溶液（鹽溶液（0.14mol/L NaCl）。）。 去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿

23、異戊醇。戊醇。 DNA沉淀：沉淀：0.3 M NaAC-70%乙乙醇。醇。第35頁/共106頁第36頁/共106頁核酸的測定方法核酸的測定方法 紫外吸收法紫外吸收法 在一定在一定pH下測定樣品的紫外吸光度（下測定樣品的紫外吸光度（A260），），即可由下式計算樣品中的核酸含量：即可由下式計算樣品中的核酸含量： 其中：其中：C為核酸的含量（為核酸的含量（mg/mL），），Mr為為相對分子質(zhì)量，相對分子質(zhì)量，A260為核酸溶液的吸光度，為核酸溶液的吸光度，為為摩爾消光系數(shù)（即摩爾消光系數(shù)（即1升溶液中含升溶液中含1摩爾核酸的光摩爾核酸的光吸收值），吸收值），L為比色杯的內(nèi)徑（為比色杯的內(nèi)徑（cm）

24、C=MrA260/L第37頁/共106頁紫外吸收法紫外吸收法 1個個A (1 OD260) 50g/ml 雙鏈雙鏈DNA 40g/ml RNA或單鏈或單鏈DNA核酸純度的測定核酸純度的測定 OD260OD280 純純DNA 比值比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染； 純純RNA 比值比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯、苯酚污染。酚污染。第38頁/共106頁核酸密度的測定核酸密度的測定 8 M CsCl，45000 rpm，16h 密度梯度：密度梯度：1.80 g/ml1.55 g/ml平衡時：浮力密度平衡時：浮力密度=CsCl密度密度=離心力離心力=0 + 4.22（r2 -

25、r02） 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離第39頁/共106頁測定測定DNA的的G-C含量含量G-C含量與含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系的浮力密度之間呈正比關(guān)系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10第40頁/共106頁定糖法定糖法 RNA的測定的測定：RNA分子中所含的分子中所含的核糖經(jīng)核糖經(jīng)濃硫酸或濃鹽酸作用脫水生成糠醛濃硫酸或濃鹽酸作用脫水生成糠醛，糠醛，糠醛可與可與3，5-二羥甲苯（二羥甲苯（苔黑酚或地衣酚苔黑酚或地衣酚）反）反應(yīng)生成應(yīng)生成綠色化合物綠色化合物，該化合物可在，

26、該化合物可在670-680 nm波長下進(jìn)行比色測定。波長下進(jìn)行比色測定。 DNA的測定的測定：DNA分子中的分子中的脫氧核糖在脫氧核糖在冰醋酸或濃硫酸存在下可與冰醋酸或濃硫酸存在下可與二苯胺二苯胺反應(yīng)生反應(yīng)生成蘭色化合物成蘭色化合物，該化合物可在，該化合物可在595-620 nm波長下進(jìn)行比色測定。波長下進(jìn)行比色測定。第41頁/共106頁RNA和和DNA中都含有中都含有磷酸磷酸，可以，可以進(jìn)行磷的測定。進(jìn)行磷的測定。純的核酸中含磷量在純的核酸中含磷量在9.5%左右左右，1 g磷相當(dāng)于磷相當(dāng)于10.5 g核酸核酸，測定核酸中磷的含量就可計算核酸，測定核酸中磷的含量就可計算核酸的含量。測定時先將核

27、酸用的含量。測定時先將核酸用強(qiáng)酸將其強(qiáng)酸將其中的磷消化成無機(jī)磷酸中的磷消化成無機(jī)磷酸，后者，后者與定磷與定磷試劑中的鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸試劑中的鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，在經(jīng)，在經(jīng)過過還原作用而生成藍(lán)色的復(fù)合物還原作用而生成藍(lán)色的復(fù)合物-鉬鉬藍(lán)藍(lán)，最后在，最后在650-660 nm進(jìn)行比色測進(jìn)行比色測定。定。第42頁/共106頁核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法，有最常用的方法，有瓊脂糖凝膠電瓊脂糖凝膠電泳泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者。前者常用于常用于DNA的分離分析，后者的分離分析，后者用于用于RNA及及DNA的分離分析。的分離

28、分析。第43頁/共106頁溴乙錠能插入溴乙錠能插入DNA分子的堿基分子的堿基對間形成復(fù)合物對間形成復(fù)合物,在紫外線照射在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光,熒光強(qiáng)熒光強(qiáng)度與度與DNA含量成正比含量成正比第44頁/共106頁第45頁/共106頁DNA核酸序列分析的簡史核酸序列分析的簡史上世紀(jì)上世紀(jì)60年代末就已掌握了充分的理論知年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當(dāng)時在某些技術(shù)能力上和研究思路上識，只是當(dāng)時在某些技術(shù)能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實。一，存在著弱點，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實。一方面，方面，如何分離寡核苷酸片段如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在；

29、另一方面，在研究思路上都沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛研究思路上都沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛。1965，Cornall大學(xué)以大學(xué)以S. W. Holley為首的科學(xué)為首的科學(xué)家小組，首次完成了家小組，首次完成了75個核苷酸的個核苷酸的酵母酵母Ala-tRNA的全序列測定的全序列測定-即利用多種即利用多種RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸降解成寡核苷酸，經(jīng)，經(jīng)分離純化分離純化后，再后，再分分別測定短片段順序別測定短片段順序。第46頁/共106頁 1968年年華裔生物化學(xué)家、生物學(xué)家華裔生物化學(xué)家、生物學(xué)家吳瑞吳瑞博士（博士（Dr. Ray Wu） 獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新

30、的引物引物一延伸一延伸測序策略測序策略，并于，并于1971年首次成功地測定了年首次成功地測定了噬菌體兩個噬菌體兩個COS末端末端的完整序列；的完整序列； 1977，F(xiàn). Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測定快速測定DNA序列的序列的末端終止法末端終止法； K. Mullis采納他的方法，完善了采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA的方法；的方法； M. Smith發(fā)明了發(fā)明了堿基定點突變技術(shù)堿基定點突變技術(shù)。這三位科。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎。學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎。第47頁/共106頁第48頁/共106頁The Sanger method is a

31、lso known as dideoxy sequencing or chain terminationThe dideoxy chain-termination method 第49頁/共106頁Sanger雙脫氧雙脫氧(鏈終止鏈終止)法法(酶法測序）酶法測序） DNA的合成總是從的合成總是從5端向端向3端端進(jìn)行，合成需要進(jìn)行，合成需要模板模板和和相相應(yīng)的引物鏈應(yīng)的引物鏈。DNA的合成過程中，在合成的的合成過程中，在合成的DNA鏈的鏈的3末末端，依據(jù)堿基配對的原則，端，依據(jù)堿基配對的原則，雙脫氧底物通過生成新的雙脫氧底物通過生成新的3,5磷酸二酯鍵，使磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的

32、鏈合成終止，產(chǎn)生短的DNA鏈。具鏈。具體測序工作中，平行進(jìn)行體測序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用，每組反應(yīng)均使用相同相同的模板的模板，相同的引物相同的引物以及以及四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)；并在四組反應(yīng)中中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接，使其隨機(jī)地接入入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的度的、不同長短的DNA鏈。這四組鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶胺凝膠電泳按鏈的長短

33、分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。 第50頁/共106頁第51頁/共106頁第52頁/共106頁MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA第53頁/共106頁每一種雙脫氧核苷酸上可以連接上一個熒光每一種雙脫氧核苷酸上可以連接上一個熒光標(biāo)記分子，使得每一段被終止位置的寡核苷標(biāo)記分子，使得每一段被終止位置的寡核苷酸片段產(chǎn)生不同的熒光。所有標(biāo)記的雙脫氧酸片段產(chǎn)生不同的熒光。所有標(biāo)記的雙脫氧核苷酸被加入同一根反應(yīng)管，結(jié)果帶不同熒核苷酸被加入同一根反應(yīng)管，結(jié)果帶不同熒光顏色的光顏色的DNA片段用毛細(xì)管電

34、泳按片段大小片段用毛細(xì)管電泳按片段大小被分離，每個片段通過激光束給出一個單一被分離，每個片段通過激光束給出一個單一峰，峰，DNA序列通過峰的顏色被閱讀。序列通過峰的顏色被閱讀。DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP第54頁/共106頁第55頁/共106頁(1)先將先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(通常為放射性通常為放射性同位素同位素32P)；(2)在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾堿基的化學(xué)修飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法在修飾堿基位置化學(xué)法斷開斷開DNA鏈鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯

35、酰胺凝膠電泳電泳將將DNA鏈按長短分開；鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出讀出DNA的的核苷酸序列核苷酸序列。第56頁/共106頁化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977原理：原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出長度只差一個利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出長度只差一個核苷酸的片段群，然后將此片段群經(jīng)測序膠電泳和核苷酸的片段群，然后將此片段群經(jīng)測序膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜。放射自顯影得到測序圖譜。 32P-GCTACGTA：在在A處：處：32P-GCT和和32P-GCTACGT在在G處：處： 32p ，32p-GCTAC在

36、在C處：處：32P-G和和 32P-GCTA在在T處：處：32P-GC和和32P-GCTACG第57頁/共106頁G反應(yīng)：硫酸二甲酯反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸反應(yīng)：甲酸/哌啶哌啶C反應(yīng)：肼反應(yīng)：肼/NaCl/哌啶哌啶C+ T：肼：肼/哌啶哌啶哌啶：促使修飾化堿基脫落，并使脫堿哌啶：促使修飾化堿基脫落，并使脫堿基的磷酸二酯鍵斷裂基的磷酸二酯鍵斷裂第58頁/共106頁32P *ACTTCGACAG硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（G）：）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（甲酸（G+A）：）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼肼/Nacl（C

37、）：）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（肼（C+T）：）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：從下往上讀：CTACGTA，末端，末端G不能讀出。不能讀出。第59頁/共106頁第60頁/共106頁第61頁/共106頁（1）酶裂解法）酶裂解法胰胰RNase A：嘧啶結(jié)尾：嘧啶結(jié)尾米曲霉米曲霉RNase T1：鳥苷酸結(jié)尾：鳥苷酸結(jié)尾黑粉菌黑粉菌RNase U2：腺苷酸結(jié)尾：腺苷酸結(jié)尾多頭黏菌多頭黏菌RNase Phy I：A、G、U結(jié)尾結(jié)尾（2）化學(xué)裂解法）化學(xué)裂解法（3）逆轉(zhuǎn)錄成）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA法

38、法RNA的測序的測序第62頁/共106頁第63頁/共106頁第64頁/共106頁雙鏈雙鏈DNA分子可以被上千分子可以被上千種從微生物中分離得到的種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（restriction enzyme）切斷切斷, 又可以又可以被被連接酶連接酶再連接起來。切斷再連接起來。切斷的過程不需要能量，而連的過程不需要能量，而連接的起來的過程卻需要接的起來的過程卻需要2個分子的個分子的ATP。這就是分這就是分子克隆和重組子克隆和重組DNA技術(shù)的技術(shù)的基礎(chǔ)?；A(chǔ)。第65頁/共106頁大部分限制性大部分限制性內(nèi)切酶識別的內(nèi)切酶識別的堿基序列為堿基序列為 6 個堿基個堿基的的回文回文

39、(palindrome )序列序列。它們在。它們在微生物細(xì)胞內(nèi)微生物細(xì)胞內(nèi)扮演的卻是扮演的卻是防防御外來御外來DNA入入侵侵的國防軍的的國防軍的作用。如何不作用。如何不把自身的把自身的DNA也降解了呢？也降解了呢？第66頁/共106頁第67頁/共106頁DNA重組示意圖重組示意圖EcoRI與與DNA的復(fù)合體的復(fù)合體第68頁/共106頁第69頁/共106頁 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物學(xué)功能有密切關(guān)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物學(xué)功能有密切關(guān)系，還能解釋系，還能解釋DNA的重要特性的重要特性-變性與復(fù)性變性與復(fù)性，這對于，這對于深入了解深入了解DNA分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有重要意義。分子結(jié)構(gòu)與

40、功能的關(guān)系有重要意義。 DNA變性變性 (Denaturation)1、DNA變性變性的的概念概念：指：指DNA分子中的分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈鏈為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。2、DNA變性的變性的本質(zhì)本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定的：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵斷裂，堿氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞基間的堆積力遭到破壞，不涉及到一級結(jié)構(gòu)的改變。，不涉及到一級結(jié)構(gòu)的改變。3、導(dǎo)致、導(dǎo)致DNA變性的變性的因素因素：凡能：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素素，如加熱、極端，如加熱、極端pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺、低離子濃度等，均可引起

41、核酸分子變性。甲酰胺、低離子濃度等，均可引起核酸分子變性。第70頁/共106頁第71頁/共106頁第72頁/共106頁DNA變性變性：雙鏈解開。：雙鏈解開。 OD260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度增加浮力密度增加 酸堿滴定曲線改變酸堿滴定曲線改變生物活性喪失生物活性喪失RNA變性變性：從局部螺旋到線團(tuán)之間的：從局部螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)變，RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒的變性引起的性質(zhì)變化沒有有DNA的明顯的明顯。第73頁/共106頁DNA變性是在一個變性是在一個很窄的很窄的溫度范圍溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，將核酸加熱變性過程中，紫

42、外光吸收值達(dá)到最大值紫外光吸收值達(dá)到最大值50%時的溫度時的溫度稱為核酸的稱為核酸的解解鏈溫度鏈溫度，由于這一現(xiàn)象與，由于這一現(xiàn)象與結(jié)晶的融解結(jié)晶的融解相類似，又稱相類似，又稱融解溫度融解溫度(Tm, melting temperature)。在。在Tm時，核時，核酸分子內(nèi)酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞被破壞。特定核酸分子的。特定核酸分子的Tm值與其值與其GC所占總堿基所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)。數(shù)的百分比成正相關(guān)。一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之間。之間。第74頁/共106頁增色效應(yīng)增色效應(yīng)(hyperchromic effect)：指：指DNA變性后變性后

43、其其紫外吸收明顯增加的效應(yīng)紫外吸收明顯增加的效應(yīng)。DNA分子中堿基分子中堿基間電子的相互作用使間電子的相互作用使DNA分子具有吸收分子具有吸收260 nm波長紫外光的特性。在波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入螺旋內(nèi)側(cè)，變性時藏入螺旋內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是雙螺旋解開，于是堿基外露堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。完全變性后核酸紫外吸收值增加：完全變性后核酸紫外吸收值增加： 天然天然DNA 2540%、RNA 約約1.1% 實質(zhì)：堿基暴露實質(zhì)：堿基暴露第75頁/共106

44、頁1.37倍倍1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g第76頁/共106頁第77頁/共106頁（1）DNA的均一性的均一性 （2）GC含量：含量： 經(jīng)驗公式：經(jīng)驗公式： XG+C（Tm69.3）2.44 或或（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度第78頁/共106頁DNA的復(fù)性：的復(fù)性： 指經(jīng)加熱變性的指經(jīng)加熱變性的DNA在適當(dāng)條件在適當(dāng)條件下，下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)一般經(jīng)緩慢緩慢冷卻冷卻后即可后即可復(fù)性

45、復(fù)性(renaturation)，此過，此過程稱之為程稱之為退火退火(annealing)。這一術(shù)語這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成。也用以描述雜交核酸分子的形成。第79頁/共106頁第80頁/共106頁DNA的復(fù)性不僅受的復(fù)性不僅受溫度影響溫度影響，還受，還受DNA自身特性自身特性等其等其它因素的影響：它因素的影響：1、溫度和時間、溫度和時間：比：比Tm 低低20-25左右的溫度是復(fù)性的左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時溫度下降必須是一溫度下降必須是一緩慢過程緩慢過程，若在超過，若在超過Tm的溫度下迅的溫度下迅速

46、冷卻至低溫速冷卻至低溫(如如4以下以下)，復(fù)性幾乎是不可能的，核，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持酸實驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性的變性(單鏈單鏈)狀態(tài)。狀態(tài)。這說明這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性降溫時間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。2、DNA濃度濃度：溶液中：溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合分子越多，相互碰撞結(jié)合的機(jī)會越大，有利于復(fù)性。的機(jī)會越大，有利于復(fù)性。3、DNA順序的復(fù)雜性：順序的復(fù)雜性：簡單順序的簡單順序的DNA分子，如多分子，如多聚聚(A)和多聚和多聚(U)這二種單鏈序列復(fù)性時，互補(bǔ)堿基的配這二種單鏈序列復(fù)性時，互補(bǔ)堿基的配對較易實現(xiàn)。順序復(fù)雜的序列要

47、實現(xiàn)互補(bǔ)則困難得多對較易實現(xiàn)。順序復(fù)雜的序列要實現(xiàn)互補(bǔ)則困難得多。 第81頁/共106頁T1/2 C const第82頁/共106頁第83頁/共106頁復(fù)性過程，復(fù)性過程，DNA的片段越大的片段越大復(fù)性越慢復(fù)性越慢，濃度越大復(fù)性越濃度越大復(fù)性越快快。一定條件下用。一定條件下用Cot來衡量來衡量復(fù)性的速度，復(fù)性的速度，Co為變性為變性DNA的原始濃度的原始濃度，以核苷酸對摩，以核苷酸對摩爾濃度表示，爾濃度表示，t為時間為時間，用秒，用秒表示。兩種濃度相同但來源表示。兩種濃度相同但來源不同的不同的DNA，復(fù)性時間長短，復(fù)性時間長短與基因組的大小有關(guān)。具有與基因組的大小有關(guān)。具有重復(fù)序列的重復(fù)序列的

48、DNA，復(fù)性也快，復(fù)性也快。第84頁/共106頁第85頁/共106頁 哺乳動物的哺乳動物的DNA 一一般均呈般均呈左左圖的曲線，這圖的曲線，這是因為它們的基因組是因為它們的基因組DNA 中插入了大量的中插入了大量的重復(fù)序列，如人的重復(fù)序列，如人的DNA中就插入了長度中就插入了長度為為350bp的的Alu序列達(dá)序列達(dá)50萬份拷貝之多。萬份拷貝之多。第86頁/共106頁第87頁/共106頁第88頁/共106頁第89頁/共106頁雜交可以發(fā)生于雜交可以發(fā)生于DNA與與DNA之之間間，也可以發(fā)生于，也可以發(fā)生于RNA與與RNA之間之間或或DNA與與RNA之間之間。第90頁/共106頁（1）（2）（3）

49、（4）（1）電泳）電泳 （2）轉(zhuǎn)膜（印跡）轉(zhuǎn)膜（印跡） （3）雜交）雜交 （4）放射自顯影）放射自顯影第91頁/共106頁P(yáng)CR是應(yīng)用是應(yīng)用最廣的分子最廣的分子生物學(xué)技術(shù)，生物學(xué)技術(shù)，在在DNA測序測序中只用了單中只用了單鏈擴(kuò)增技術(shù)，鏈擴(kuò)增技術(shù)，所產(chǎn)生的模所產(chǎn)生的模板板DNA并不并不指數(shù)上升，指數(shù)上升，而只以熱循而只以熱循環(huán)數(shù)為倍數(shù)。環(huán)數(shù)為倍數(shù)。需要：模板需要：模板DNA、引物、底物（、引物、底物（dNTPs）、）、DNA Pol (Taq)、擴(kuò)增緩沖液。變性（擴(kuò)增緩沖液。變性（94）-退火退火-延伸（延伸（72）循環(huán)。循環(huán)。第92頁/共106頁第93頁/共106頁利用足跡法確定利用足跡法確定 RNA 聚合酶結(jié)合聚合酶結(jié)合位點的實驗位點的實驗第94頁/共106頁原位分子雜交原位分子雜交 （in situ hybridization）熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）