熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)

1、1.1Page 1熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-71.1Page 2熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7什么是顯微鏡熒光檢測？什么是顯微鏡熒光檢測？一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標(biāo)本一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標(biāo)本:1）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或2）利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒）利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和

2、顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮度）。度）。其中：其中：1）為自發(fā)熒光，）為自發(fā)熒光，2）為繼發(fā)熒光。）為繼發(fā)熒光。1.1Page 3熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7落射熒光與透射光觀察的區(qū)別落射熒光與透射光觀察的區(qū)別1.1Page 4熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7落射熒光與透射光觀察的區(qū)別落射熒光與透射光觀察的區(qū)別什么是熒光 ?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光

3、1.1Page 6熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率1.1Page 7熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：檢出能力高（放大作用）對細(xì)胞的刺激小（可以活體染色）能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光素?zé)晒獾挠袩o、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析1.1Page 8熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7標(biāo)本制作的順序標(biāo)本制作的順序組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片

4、、染色、封片組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片、染色、封片培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞1.1Page 9熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7組織固定組織固定活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué)活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué)改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：（1）最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；）最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)

5、構(gòu)；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中是禁用的；是禁用的；（3）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會使上皮細(xì)胞產(chǎn)生非特異性熒光；使上皮細(xì)胞產(chǎn)生非特異性熒光；（4）固定劑的選擇、固定時間、溫度和）固定劑的選擇、固定時間、溫度和PH值都會影響實驗結(jié)果。值都會影響實驗結(jié)果。1.1Page 10熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7單純固定液單純固定液（

6、1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、及免疫組化、PCR等工作。中性等工作。中性甲醛是以甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時間不超過一個甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時間不超過一個月。月。 甲醛（甲醛（40%） 100ml無水磷酸氫二鈉無水磷酸氫二鈉 6.5g磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水蒸餾水 900ml1.1P

7、age 11熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7單純固定劑單純固定劑（2）乙醇固定液：使用時以）乙醇固定液：使用時以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保存組織中的核酸強于中性甲醛，故常用于有核滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保存組織中的核酸強于中性甲醛，故常用于有核酸操作的實驗或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于酸操作的實驗或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定組織。乙醇固定組織。（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。多聚甲醛固定液

8、：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。1.1Page 12熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7混合固定液混合固定液（1）乙醇）乙醇-甲醛（乙醇甲醛（乙醇-福爾馬林，福爾馬林，AF）固定液：適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定）固定液：適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入液有固定兼脫水作用，固定后的標(biāo)本可直接入95%乙醇脫水。乙醇脫水。甲醛（甲醛（40%） 100ml95%乙醇乙醇 900ml（2）B5（醋酸鈉（醋酸鈉-升汞升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。無水醋

9、酸鈉無水醋酸鈉 1.25g升汞升汞 6.0g蒸餾水蒸餾水 90ml使用前加入甲醛使用前加入甲醛 10ml1.1Page 13熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7混合固定液混合固定液（3）Bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮很液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。飽和苦味酸水溶液（約飽和苦味酸水溶液（約1.22%） 75ml甲醛甲醛 25ml冰醋酸冰醋酸 5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適用于固定外膜

10、致固定液：穿透能力強，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適用于固定外膜致密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。無水乙醇無水乙醇 60ml氯仿氯仿 30ml冰醋酸冰醋酸 10ml1.1Page 14熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7混合固定液混合固定液（5） Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。升汞升汞 5.0g重鉻

11、酸鉀重鉻酸鉀 2.5g硫酸鈉硫酸鈉 1.0g蒸餾水（加至）蒸餾水（加至）100ml1.1Page 15熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7取材取材組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。細(xì)胞標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本的取材（1）貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞）貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞（2）懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞：）懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞： 沉淀涂片，細(xì)胞離心涂片器（沉淀涂片，細(xì)胞離心涂片器（cytospin），）， 載玻片上

12、涂粘附劑載玻片上涂粘附劑多聚賴氨酸（多聚賴氨酸（0.010.5%），）， 甲醛甲醛-明膠，鉻礬明膠，明膠，鉻礬明膠， Vectabond試劑試劑（3）體液沉淀涂片法）體液沉淀涂片法（4）穿刺吸取涂片法）穿刺吸取涂片法（5）印片法）印片法1.1Page 16熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7組織脫水組織脫水試劑試劑濃度溫度濃度溫度時間設(shè)定時間設(shè)定中性緩沖甲醛中性緩沖甲醛乙醇乙醇乙醇乙醇乙醇乙醇過夜過夜無水乙醇無水乙醇無水乙醇無水乙醇二甲苯無水乙醇二甲苯無水乙醇體積比為：體積比為：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯石蠟石蠟石蠟石蠟 石蠟石蠟 1.1Page 17熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)20

13、22-5-7包埋包埋組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。包埋步驟包埋步驟先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺商，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再埋托中央，放在小冷臺商，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟

14、，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應(yīng)根據(jù)組織的不同，加好石蠟，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應(yīng)根據(jù)組織的不同，選擇大小型號合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍選擇大小型號合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r立住，達(dá)到立埋的要求。停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r立住，達(dá)到立埋的要求。1.1Page 18熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7切片切片冰凍切片冰凍切片為免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠比較完好地保存多種為免疫組織化學(xué)染色中最常用的一

15、種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠比較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的組織均可作冰凍切片。組織均可作冰凍切片。 冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中保存。保存。要注意刀片等接觸陽性物質(zhì)的污染問題。要注意刀片等接觸陽性物質(zhì)的污染問題。1.1Page 19熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7切片切片石蠟切片石蠟切片其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良

16、好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能連續(xù)切片（薄其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能連續(xù)切片（薄片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進(jìn)用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進(jìn)行。行。脫水、透明等過程應(yīng)在脫水、透明等過程應(yīng)在4下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失；下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失；組織塊大小應(yīng)限于組織塊大小應(yīng)限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸臘；，使組織充分脫水、透

17、明、浸臘；浸臘、包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在浸臘、包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在60以下，以熔點低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）；以下，以熔點低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）；石蠟切片應(yīng)放在石蠟切片應(yīng)放在37恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于可存放于4冰箱內(nèi)備用；冰箱內(nèi)備用；冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失?？乖膩G失。1.1Page 20熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-

18、7切片切片振動切片振動切片 可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成20100um的厚片，以漂浮法進(jìn)行染色。組織不冰凍，的厚片，以漂浮法進(jìn)行染色。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能比較好地保留組織細(xì)胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原?？乖膿p害，能比較好地保留組織細(xì)胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原。1.1Page 21熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7封片封片封片劑封片劑常用甘油和常用甘油和0.5mol/L pH9.09.5的

19、碳酸鹽緩沖液的等量混合液。的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。如需將染色后的樣品保存一段時間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。如需將染色后的樣品保存一段時間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用DPX。由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用PBS或生理鹽水也可以。或生理鹽水也可以。1.1Page 22熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7組織和細(xì)胞的自發(fā)性熒光檢測組織和細(xì)胞的自發(fā)性熒光檢測1、動物組織一般呈

20、現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強；、動物組織一般呈現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強；2、紅細(xì)胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)合，鐵離子有抑制熒光作用，、紅細(xì)胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)合，鐵離子有抑制熒光作用，所以紅細(xì)胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細(xì)胞可呈紅色熒光；所以紅細(xì)胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細(xì)胞可呈紅色熒光；3、細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細(xì)胞核兩側(cè)的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長或在某些疾病的情、細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細(xì)胞核兩側(cè)

21、的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長或在某些疾病的情況下，可見較大量的棕黃色脂褐素?zé)晒忸w粒；況下，可見較大量的棕黃色脂褐素?zé)晒忸w粒；4、某些腫瘤細(xì)胞在紫外或藍(lán)光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷；、某些腫瘤細(xì)胞在紫外或藍(lán)光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷；5、維生素、維生素A呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素A后，在肝細(xì)胞、后，在肝細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞、腎上腺束狀帶細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎上腺束狀帶細(xì)胞、肺和腎的間質(zhì)細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和黃體細(xì)胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見到維生素和腎的間質(zhì)細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和黃體細(xì)胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見到維生素A的綠色熒光；的

22、綠色熒光；6、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合，、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動物以觀察新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細(xì)胞有較大的親合力，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動物以觀察新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細(xì)胞有較大的親合力，能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶；能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶；7、有機體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的內(nèi)源性生物胺、有機體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的內(nèi)源性生物胺兒茶酚

23、胺、兒茶酚胺、5-羥色胺和羥色胺和組織胺等與某些醛類物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。組織胺等與某些醛類物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。1.1Page 23熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7熒光組織細(xì)胞染色（熒光探針檢測，熒光標(biāo)記檢測）熒光組織細(xì)胞染色（熒光探針檢測，熒光標(biāo)記檢測）1.1Page 24熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7熒光染色方法熒光染色方法浸染（組織或細(xì)胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細(xì)胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適浸染（組織或細(xì)胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細(xì)胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固

24、，染色時間需要比較長，染色均勻。用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固，染色時間需要比較長，染色均勻。滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細(xì)胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細(xì)胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固定不是很牢固，染色時間較短。染色不易均勻，特別是時間比較長時，需添加染料。定不是很牢固，染色時間較短。染色不易均勻，特別是時間比較長時，需添加染料。漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細(xì)胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細(xì)胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織片，或黏附在一些膜上的組織細(xì)胞

25、，染料使用相對較少。由于樣品一般是反過來面朝下片，或黏附在一些膜上的組織細(xì)胞，染料使用相對較少。由于樣品一般是反過來面朝下（染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。（染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。1.1Page 25熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架F-actin（F-肌動蛋白）染色：肌動蛋白）染色：用用FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin（鬼筆環(huán)肽）。（鬼筆環(huán)肽）。F-肌動蛋白是大多數(shù)真核細(xì)胞中以聚合絲形式存在的肌動蛋白。肌動蛋白是大多數(shù)真核細(xì)胞中以聚合絲形式存在的肌動蛋白。Phalloidin能與細(xì)胞內(nèi)的能

26、與細(xì)胞內(nèi)的F-actin特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)Phalloidin上結(jié)合的熒光標(biāo)記，使上結(jié)合的熒光標(biāo)記，使F-肌動蛋白被觀察到。肌動蛋白被觀察到。FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin，溶于甲醇中制成貯存液（，溶于甲醇中制成貯存液（200u/ml），染色時終濃度），染色時終濃度為為5u/ml。細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片 PBS洗滌洗滌 2%戊二醛固定戊二醛固定15分鐘分鐘 PBS洗滌洗滌 0.2%Triton X-100抽提抽提2分鐘分鐘 PBS洗滌洗滌 FITC或或Rhodamine標(biāo)記的標(biāo)記的Phalloidin室溫室溫20分鐘分鐘 PBS洗滌，觀察。洗

27、滌，觀察。 1.1Page 26熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7Fluorochromes and StainsnDAPI, Hoechst, SYTO 16: semipermeant and permeant DNA stain, apoptosisnGFP: used in living systems as a gene/protein reporternLucifer yellow, Fluorogold: neuronal tracernMitoFluor green, MitoTracker green: mitichondrial marker1.1Page 27

28、熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7nDiI: lipophilic membrane markernRhodamine 6G, MitoTracker red: mitochondrial and ER markernPropidium iodide, Ethidium Bromide, SYTO 25: impermeant and permeant nucleic acid stainTO-PRO-3Alexa 488Alexa 568Human colon cryptChristine Anderson,Laboratory of Prof. Ray White,Hunsts

29、man Cancer Institute, Utah1.1Page 29熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7細(xì)胞熒光離子探針細(xì)胞熒光離子探針游離鈣離子含量測定：游離鈣離子含量測定：有有Fura 2 AM, Indo 1和和Fluo 3AM, 前兩者激發(fā)波長為紫外，而且均是雙激發(fā)波長的比率熒光，前兩者激發(fā)波長為紫外，而且均是雙激發(fā)波長的比率熒光，所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用Fluo 3AM。Ex/Em: 506/526。Fluo 3本身不發(fā)熒光，只有當(dāng)與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出

30、熒光。本身不發(fā)熒光，只有當(dāng)與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。Fluo 3AM不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（Fluo 3 不能透過細(xì)胞膜進(jìn)不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞后的入細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞后的Fluo 3AM中的中的AM被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解，變?yōu)楸患?xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解，變?yōu)镕luo 3，F(xiàn)luo 3與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強弱直接反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強弱直接反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子 的含量。的含量。Fluo 3AM 染色：染色：Fluo 3AM用用DMSO

31、配成貯存液，冰凍保存，使用時終濃度為配成貯存液，冰凍保存，使用時終濃度為1uM。染色一。染色一般為般為37，3045分鐘。分鐘。Fluo 3染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可以通過時間掃描，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動態(tài)觀察。染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可以通過時間掃描，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動態(tài)觀察。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)pH的測定：的測定：SNAFL：雙發(fā)射波長比率熒光。：雙發(fā)射波長比率熒光。 Ex: 514(488), Em: 580/640BCECF：雙激發(fā)波長比率熒光。：雙激發(fā)波長比率熒光。 Ex: 490/440, Em: 5301.1Page 30熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7Physio

32、logy ProbesnIndo-1, Fura-2: dual emission or dual excitation calcium probenCalcium green, Fluo-3: single wavelength calcium probenBCECF: single or dual excitation wavelength pH probenJC-1: potential sensitive mitochondrial dual emissionnCalcein: volume changes, gap junctions, liposomes, permeability

33、nLysosensor Blue DND-192, LysoSensor Green DND-153: lysosomal markernNBD-C6 ceramide: Golgi markernRhodamine-123: mitochondrial marker1.1Page 31熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7nSNARF: pH indicator emission rationFM1-43, RH-414: plasma membranenFura red: calcium indicator, decreased fluorescence on bindingnDI

34、C18(3), DIC16(3): ER markernLysoTracker Yellow DND-68: lysosomal markernMitoTracker Orange, Rhodamine B Hexyl ester, Tetramethylrosamine: mitochondrial marker1.1Page 32熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7Mouse; hippocampal neurons;fluorescence of GFPShigeo OkabeDepartment of Anatomy and Cell BiologyTokyo Medical

35、 and Dental University1.1Page 33熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本

36、，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較常用）熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較常用） 熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的熒光素以異硫氰酸熒光素（免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的熒光素以異硫氰酸熒光素（FITC綠色熒光）、羅丹明（綠色熒光）

37、、羅丹明（TRITC橙紅橙紅色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC橙紅色熒光），橙紅色熒光），Cy3（橙紅色熒光），（橙紅色熒光），Cy5（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。 1.1Page 34熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補體法四種。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補體法四種。1、直接法：、直接法：1）檢查抗原法：（最早的方法）檢查抗原法：（最早的方法）用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)

38、用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。該方法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。該方法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。2）檢查抗體法：）檢查抗體法：將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測出來。體定位檢測出來。 1.1Page 35熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-

39、72、間接法：、間接法：1）檢查抗體法（夾心法）檢查抗體法（夾心法）先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。2）檢查抗體法）檢查抗體法用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待測血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待測血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接

40、熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。病原體抗體的重要手段。1.1Page 36熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-73）檢查抗原法雙薄片）檢查抗原法雙薄片先用特異性（對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽先用特異性（對細(xì)胞

41、或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體抗體-熒光抗體的復(fù)合物。熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個分子結(jié)合上每個分子結(jié)合35個分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時又可結(jié)合個分子抗體，當(dāng)此抗體

42、作為抗原時又可結(jié)合35個分子的熒光抗體，個分子的熒光抗體，所以與直接法相比熒光亮度可增強所以與直接法相比熒光亮度可增強34倍。倍。靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。是目前靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。是目前使用得最廣泛的技術(shù)。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。使用得最廣泛的技術(shù)。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。1.1Page 37熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-73、補體法、補體法1）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法用抗補體用抗補體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原

43、抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而形成抗原抗體補體復(fù)合物形成抗原抗體補體復(fù)合物 抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。2）間接檢查組織內(nèi)抗原法）間接檢查組織內(nèi)抗原法常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原補體抗孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗

44、體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原抗體抗體抗補體熒光抗體的復(fù)合物。抗補體熒光抗體的復(fù)合物。此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。缺點為容此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標(biāo)記顯示。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。 1.1Page 38熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-74、雙（多）重免疫熒光標(biāo)記法、雙（多）重免疫熒光標(biāo)記法在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需同時檢查兩種或兩種以上抗原時，要進(jìn)行雙（多）重?zé)晒馊旧?。在同一?xì)胞組織標(biāo)本上需同時檢查兩

45、種或兩種以上抗原時，要進(jìn)行雙（多）重?zé)晒馊旧Ｒ话憔捎弥苯臃?。將這些熒光抗體（如抗一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗A和抗和抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上（也可分）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上（也可分別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標(biāo)記抗體最好用波長范圍別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標(biāo)記抗體最好用波長范圍分得比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。分得比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。1.1Page 39熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-71.1Page 40熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7研究中常用熒光染料和探針研究中常用

46、熒光染料和探針細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記：免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián)與抗體耦聯(lián), 直標(biāo): 一抗+熒光探針 間標(biāo): 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗體+熒光探針) 肌動蛋白actin ( Palloidine+熒光探針)1染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價的熒光抗體，在室溫或37染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 2洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。3用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.09.5）甘油封固、鏡檢 1

47、.1Page 41熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針細(xì)胞膜表面受體配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2) 標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC1 .切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。 2 .再滴加間接熒光抗體，染色30min，37，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。 1.1Page 42熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)

48、2022-5-7研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅) Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/6181.1Page 43熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù)2022-5-7研究中常用熒光染料和探針研究中常用熒光染料和探針2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢 測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時間短 JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜