基因工程：第六章

1、基因工程：第六章 由DNA分子的體外重組，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等適當途徑引入宿主，會得到大量的重組體細胞或噬菌體。在這些眾多的重組體中，會有多種類型的DNA分子，包括：不帶任何外源DNA插入片段，僅由線性載體分子自身連接形成的環(huán)狀DNA分子；由一個載體分子和一個或數(shù)個外源DNA片段構(gòu)成的重組體DNA分子；單純由數(shù)個外源DNA片段彼此連接形成的多聚DNA分子。 第1頁/共41頁 對于這些由混合的DNA制劑轉(zhuǎn)化而來的大量的克隆群體，需要采用特殊的方法，才能選擇和鑒定出可能含有目的基因的重組體克隆。目前已發(fā)展和應(yīng)用了一系列重組體克隆檢測法，包括遺傳檢測法、物理檢測法、使用特異性探針的核酸雜交法，以及

2、免疫化學(xué)法等。 第2頁/共41頁 6.1 利用表型特征選擇（遺傳檢測法） 表型是指機體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。這里所說的供篩選用的表型特征來自兩個方面：一個是克隆載體提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者應(yīng)用較多。 第3頁/共41頁 6.1.1 利用載體提供的表型特征選擇重組體分子 1. 抗藥性標記插入失活選擇法 檢測外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。例如在pBR322質(zhì)粒的DNA序列上，編碼有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因內(nèi)有Bam HI和Sal I兩種限制酶的單一切點。在這兩個識別位點中的任何插

3、入作用，都會導(dǎo)致Tetr基因出現(xiàn)功能性失活，因而根據(jù)AmprTets表型即可篩選出在Tetr基因內(nèi)帶有插入DNA片段的重組體細胞。 第4頁/共41頁第5頁/共41頁 利用環(huán)絲氨酸富集法可以簡化這種插入失活檢測法的程序，該法可以使那些只帶有原來質(zhì)粒載體的細菌致死，從而抑制不含有插入DNA片段的載體分子形成轉(zhuǎn)化子。例如： 當外源DNA 插入在pBR322質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(Tetr)上，該基因便會立即失去它的功能作用，而另一種抗菌素抗性基因氨芐青霉素基因(Ampr)，則仍然是完整的。將轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)物移至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，經(jīng)過這樣的選擇作用而得以存 活 下 來 的 所 有 細 胞 ，

4、 都 應(yīng) 該 帶 上 了pBR322質(zhì)粒分子。 第6頁/共41頁 在這些pBR322質(zhì)粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列內(nèi)具有DNA插入片段的重組質(zhì)粒。把這種富集了的培養(yǎng)物作適當?shù)南♂尯?，轉(zhuǎn)接到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長，于是在其pBR322質(zhì)粒分子的Tetr基因序列中帶有DNA插入片段的所有細胞，都將停止生長（注意：四環(huán)素不會使細胞死亡，只是抑制細胞的生長）。最后加入環(huán)絲氨酸，就會促使所有正在生長著的細胞發(fā)生溶胞反應(yīng)，那些沒有發(fā)生溶胞反應(yīng)而存活下來的細胞，大約有90100%都帶有pBR322重組質(zhì)粒，且在其Tetr基因上都含有一個插入的外源DNA片段，這些細胞可通過離心作用收集起來。 第

5、7頁/共41頁 此外，在pBR322質(zhì)粒的Ampr基因序列中，也有一個Pst I限制酶的唯一識別位點。Ampr基因正常情況下表達產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，在其作用下青霉素會變成青霉酮酸，當加入碘-青霉素指示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6.4的磷酸緩沖液），AmprTetr菌落為無色透明。但當pBR322質(zhì)粒的Ampr基因插入失活后，AmprTets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的藍灰色。根據(jù)菌落周圍指示液顏色的改變與否，很容易鑒別出重組體菌落。第8頁/共41頁第9頁/共41頁 這種方法的優(yōu)點是無需把每一個轉(zhuǎn)化子接種在Amp和Tet平板上，直接在轉(zhuǎn)化平板上即可

6、鑒定。其缺點是由于把指示液直接加入選擇平板內(nèi)，極易超成菌落之間的相互污染，給其后的鑒定帶來困難。目前使用紙片法使這一方法得到了改善：預(yù)先將一定大小的紙片浸泡在指示液中，干燥后密閉保存，使用時只要將紙片覆蓋在轉(zhuǎn)化平板上，數(shù)分鐘內(nèi)就可以觀察到結(jié)果。 第10頁/共41頁 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 將pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞，培養(yǎng)在補加有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中時，由于基因內(nèi)互補作用形成的有功能的半乳糖苷酶，會把培養(yǎng)基中無色的X-gal切割成半乳糖和深藍色的底物，使菌落呈現(xiàn)出藍色反應(yīng)。 當pUC質(zhì)粒載體的lacZ 序列插入了外源DNA片段時，會阻斷讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)

7、果產(chǎn)生出白色的菌落。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源DNA插入序列的重組體克隆。 第11頁/共41頁 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征選擇重組體分子 這種選擇法要求所克隆的DNA片段是一個完整的序列，而且能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)功能的表達。其依據(jù)的基本原理是：轉(zhuǎn)化進來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）的分離： 第12頁/共41頁 先 將 含 有 D H F R -m R N A 的 小 鼠 總m R N A 制 劑 反 轉(zhuǎn) 錄 成

8、c D N A 拷 貝 ， 構(gòu) 建cDNA基因文庫。根據(jù)小鼠DNFR對于藥物三甲氧芐二氨嘧啶呈現(xiàn)抗性這種性狀特征，將轉(zhuǎn)化的細菌生長在含有三甲氧芐二氨嘧啶的培養(yǎng)基中（其含量水平為可以抑制大腸桿菌的DHFR的活性），選擇轉(zhuǎn)化子。這樣分離出來的抗性克隆，顯然都是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，賦予寄主細胞新的抗性表型所致。 第13頁/共41頁 6.1.3 利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子 把DNA包裝成有活性的噬菌體顆粒，主要取決于兩個因素：一是要具有能被噬菌體包裝蛋白和頭部前體所識別的區(qū)域，即cos區(qū)；二是DNA的長度，只有重組體DNA是野生型 DNA的75105%的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成清

9、晰的噬菌斑，而單一的載體DNA是不會包裝成活的噬菌體顆粒的。第14頁/共41頁 經(jīng)體外包裝，轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑，尤其是對替換型載體，本身就是一種可利用的選擇標記。 另外cI基因插入失活后，會誘發(fā)溶源性細菌的原噬菌體進入溶菌周期，根據(jù)產(chǎn)生噬菌斑的清晰與混濁，也可以進行選擇。第15頁/共41頁 6.2 利用核酸雜交篩選 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù)。它所依據(jù)的原理是放射性同位素（32P或125I）標記的DNA或RNA探針進行DNA-DNA或DNA-RNA雜交，利用同源DNA堿基配對的原則檢測特定的重組克隆。第16頁/共41頁 核酸雜交篩選

10、法的最大優(yōu)點是它可以普遍廣泛地應(yīng)用，尤其適合于大量群體的篩選，只要有現(xiàn)成可用的特異性探針，就可以有效地檢測任何一種插入的外源DNA序列，而不以這種序列能否在大腸桿菌中實現(xiàn)基因表達為前提。第17頁/共41頁 6.2.1 原位雜交篩選 生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原來的位置不變地影印在硝酸纖維素濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，而將母板很好地保存起來。因為變性DNA同硝酸纖維素濾膜有很強的親和力，便在膜上形成DNA的印跡，在80下烘烤濾膜，使DNA牢固地固定下來。第18頁/共41頁 用放射性同位素標記的RNA或DNA為探針同濾膜上的菌落所釋放的變性DNA雜交，并用放射自顯

11、影技術(shù)進行檢測，凡是含有與探針互補序列的菌落DNA，就會在X光膠片上出現(xiàn)曝光點。根據(jù)曝光點的位置，便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽性菌落或噬菌斑，這就是所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。第19頁/共41頁 6.2.2 核酸雜交檢測的探針 進行核酸分子雜交的前提是要有特定的DNA或RNA作探針。具有一定已知序列的核酸片段，大小通常為20kb左右，再帶上一定的探測標記，就構(gòu)成了核酸探針。它可以通過分子雜交與待測基因的DNA序列結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，從而把待測基因的質(zhì)和量顯示出來。第20頁/共41頁 1. 放射性探針 廣 泛 使 用 的 探 針 ， 多 是 以32PdNTP為標記前體

12、，通過缺口轉(zhuǎn)移的方法，把天然DNA或RNA片段標記上放射性同位素。 此外還可以化學(xué)合成DNA探針，只要已知目的基因產(chǎn)物的部分氨基酸序列，就可以從這個信息中，反推出基因編碼區(qū)可能的核苷酸排列順序。選擇一小段含有獨特密碼子（Met和Try）或簡并性最小的密碼子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化學(xué)法合成出相當于這些密碼子序列的寡核苷酸片段（1020個堿基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，將32PdNTP轉(zhuǎn)移到合成的DNA的5-OH末端（稱為末端標記 ），即成為標記好的探針。第21頁/共41頁一個密碼子： Met （甲硫氨酸） AUG Try （色氨酸） UGG二個密碼子： Cys

13、（半胱氨酸） His （組氨酸） Phe （苯丙氨酸） Try （酪氨酸） Lys （賴氨酸） 第22頁/共41頁 2. 非放射性探針 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且對人體有一定的損害，因而近年來又研制了非放射性物質(zhì)標記核酸的方法，如糖基化探針、生物素探針、毛地黃苷標記等。 用生物素標記DNA形成探針是目前用得較多的一種，它可以采用酶促或光促生物素來標記核酸。酶促法是利用缺口轉(zhuǎn)移的方法，但標記前體不是32PdTTP，而是用嘧啶環(huán)C5位連接了生物素的dTTP（或dUTP），它可以有效地摻入DNA中形成生物素探針。第23頁/共41頁 光促法使用的試劑為光敏生物素乙酸鹽，它

14、是由光敏基團、連接臂和生物素組成的。光敏基團可在光照下活化，與核酸的堿基結(jié)合，連接臂可以降低生物素基團對核酸雜交的空間位阻；生物素用做標記物。將待標記的核酸（DNA或RNA）與光敏生物素乙酸鹽混合，在近紫外的光源（如高壓汞燈、碘鎢燈）下照射1520分鐘，就可將生物素標記在單鏈或雙鏈的DNA或RNA上，形成穩(wěn)定的共價結(jié)合。第24頁/共41頁 標記好的生物素探針，可用于核酸的雜交反應(yīng)，然后用親和素-酶系統(tǒng)來顯示。親和素可以特異地與生物素結(jié)合，酶可與底物反應(yīng)進行顯色或化學(xué)發(fā)光，這就相當于放射性同位素探針雜交后的放射自顯影。最常用的工具酶是辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。 非放射性方法進

15、行核酸雜交，其靈敏度不如放射性方法高，但非放射性探針具有安全、穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點，是一種正在發(fā)展很有前途的方法。第25頁/共41頁 6.3 利用免疫學(xué)方法篩選 免疫學(xué)方法專一性很強、靈敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主細胞中的表達產(chǎn)物（多肽）作抗原，以該基因產(chǎn)物的免疫血清作抗體，通過抗原抗體反應(yīng)將目的基因克隆檢出。 免疫學(xué)方法可以分為兩種：即放射性抗體測定法和免疫沉淀測定法。這些方法最突出的優(yōu)點是，它們直接檢測重組克隆所表達的蛋白產(chǎn)物，能夠檢測無任何可供選擇的表型特征的重組克隆。當然這種方法必須具備有效的特異性抗體。第26頁/共41頁6.3.1 放射性抗體測定法 這一方法所依據(jù)的原理為

16、： (1) 一種免疫血清含有好幾種特異性抗體（IgG），它們識別抗原分子上的不同定子，并分別同各自識別的抗原定子相結(jié)合； (2) 抗體分子或抗體的F(ab)部分，能夠十分牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯等塑料制品）上，而不會被洗脫掉； (3) 通過體外碘化作用，IgG抗體便會迅速地被放射性同位素125I標記上。第27頁/共41頁 放射性抗體測定的主要程序是：(1) 首先把轉(zhuǎn)化的菌落涂布在平板上，長出菌落以后，再影印到另一塊平板上繼續(xù)培養(yǎng)，并保留原來的平板作為母板；(2) 待影印平板上的菌落長好后，置于含有氯仿飽和氣體的容器中使菌落裂解，陽性菌落便釋放出抗原；(3) 將吸附了未標記IgG抗體的聚乙

17、烯薄膜覆蓋在平板表面，如果抗原與抗體具有對應(yīng)關(guān)系，則在薄膜上形成抗原-抗體復(fù)合物；第28頁/共41頁(4) 取下聚乙烯薄膜，再用125I 標記的IgG處理，125I-IgG便會與結(jié)合在聚乙烯薄膜上的抗原決定簇結(jié)合；(5) 漂洗聚乙烯膜除去過剩的125I-IgG，干燥后進行放射性自顯影判斷結(jié)果，并從母板上獲得相應(yīng)的重組克隆。第29頁/共41頁第30頁/共41頁 對于能夠分泌表達產(chǎn)物的重組體克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更為簡化。例如分泌胰島素重組體克隆的篩選：第31頁/共41頁第32頁/共41頁 在放射免疫分析法基礎(chǔ)上，最近又發(fā)展了一類非放射性免疫分析技術(shù)，例如熒光免疫分析、酶免疫

18、分析以及化學(xué)發(fā)光免疫分析等。這些方法具有和放射免疫法相同的靈敏度和特異性，而且沒有象同位素那樣的半衰期短和安全防護問題，是一類很有發(fā)展前途的檢測技術(shù)。第33頁/共41頁 6.3.2 免疫沉淀測定法 相對于放射性免疫法，該方法靈敏度要低，而且易受干擾，但它的價值在于實驗簡便易行。其做法是：在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。如果有些菌落的細菌會分泌出某種蛋白質(zhì)，那么在它的周圍就會出現(xiàn)一條叫做沉淀素的抗體-抗原沉淀物所形成的白色的圓圈。第34頁/共41頁 6.1.1 利用載體提供的表型特征選擇重組體分子 1. 抗藥性標記插入失活選擇法 檢測外源DNA插入作用的一種通用的

19、方法是插入失活效應(yīng)。例如在pBR322質(zhì)粒的DNA序列上，編碼有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因內(nèi)有Bam HI和Sal I兩種限制酶的單一切點。在這兩個識別位點中的任何插入作用，都會導(dǎo)致Tetr基因出現(xiàn)功能性失活，因而根據(jù)AmprTets表型即可篩選出在Tetr基因內(nèi)帶有插入DNA片段的重組體細胞。 第35頁/共41頁 利用環(huán)絲氨酸富集法可以簡化這種插入失活檢測法的程序，該法可以使那些只帶有原來質(zhì)粒載體的細菌致死，從而抑制不含有插入DNA片段的載體分子形成轉(zhuǎn)化子。例如： 當外源DNA 插入在pBR322質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(Tetr)上，該基因便會立即失去它的功能作用，而另一種抗菌素抗性基因氨芐青霉素基因(Ampr)，則仍然是完整的。將轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)物移至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，經(jīng)過這樣的選擇作用而得以存 活 下 來 的 所 有 細 胞 ， 都 應(yīng) 該 帶 上 了pBR322質(zhì)粒分子。 第36頁/共41頁 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 將pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞，培養(yǎng)在補加有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中時，由于基因內(nèi)互補作用形成的有功能的半乳糖苷酶