病毒的純化及保存

1、病毒的純化和保存病毒純化目的(了解)n為了了解病毒的結(jié)構(gòu)、傳染與免疫、遺傳與變異等性質(zhì)，常常需要高純度的病毒病毒純化原理病毒純化原理(熟悉熟悉)n利用物理或化學(xué)的方法盡可能地去除宿主細(xì)胞中的組分，將病毒從其宿主細(xì)胞內(nèi)提純出來，在純化過程中保持病毒的生物活性生物活性和感染性感染性。病毒純化的一般原則病毒純化的一般原則(熟悉熟悉)n1、釋放病毒到胞外、釋放病毒到胞外 1.1 容易釋放病毒(培養(yǎng)液/尿囊液) 1.2 不容易釋放病毒(細(xì)胞破碎)n2、去除細(xì)胞碎塊、去除細(xì)胞碎塊 低速離心，以20006000r/min離心3040分鐘，可除去90以上的細(xì)胞碎片和雜質(zhì) n3、病毒懸液濃縮、病毒懸液濃縮細(xì)胞破

2、碎方法細(xì)胞破碎方法(熟悉熟悉)n超聲破碎：密集的小氣泡迅速炸裂，破壞細(xì)胞n高壓勻漿：機(jī)械切割力n高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑 n酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶n化學(xué)滲透：滲透壓改變使細(xì)胞破裂n反復(fù)凍融：形成冰晶，使細(xì)胞膨脹破裂 病毒純化方法病毒純化方法聚乙二醇(PEG)濃縮法nPEG是環(huán)氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子聚合物，無毒、無刺激性。n平均分子量不同，性質(zhì)也有差異。分子量200600者常溫下是無色無臭粘稠液體，分子量在600以上者就逐漸變?yōu)榘牍腆w狀、蠟狀固體。n隨著分子量的增大，其吸濕能力相應(yīng)降低。 不同分子量PEG性質(zhì)比較聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n分子量200

3、06000的PEG用于病毒濃縮n PEG可使病毒顆粒形成多聚體，較低離心力即可沉淀 n(1)直接加入法 病毒懸液量少時(shí)候使用此法； 病毒懸液中加入8%-10%的PEG聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n(2)液體濃縮法 聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n(3)固體濃縮法 將PEG固體覆蓋于裝有病毒懸液的透析袋上，進(jìn)行濃縮。 透析袋孔徑大小超過濾法(熟悉)n原理：利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將大分子或病毒等顆粒截留。n超濾膜孔徑要比病毒顆粒小n只能去除比病毒小的細(xì)胞碎塊吸附法(熟悉)n原理：病毒顆粒表面離子與吸附劑有親和性，病毒吸附之后，使用適當(dāng)?shù)臈l件將病毒洗脫下來。n吸附劑必須具備的特點(diǎn)：

4、較大的表面積和吸附能力； 較高的吸附選擇性； 便于洗脫； 性質(zhì)穩(wěn)定；凝膠吸附法-磷酸鈣凝膠n常用的凝膠，由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物，用0.001 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，置于445天，使之充分沉淀后應(yīng)用。凝膠吸附法-氫氧化鋅凝膠n是由7 mol/L氨水與0.1 mol/L醋酸鋅溶液滴加混合(pH8.5)制備，在制備后數(shù)小時(shí)內(nèi)較穩(wěn)定。n方法：將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合，使它們形成復(fù)合體后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解離回收病毒。 凝膠吸附法-焦磷酸鎂凝膠n是由0.1 mol/L焦磷酸鈉和0

5、.1 mol/L MgCl2，以2：10(體積)比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩(wěn)定的焦磷酸鎂凝膠。n將牛痘病毒懸液同此凝膠混合，使病毒吸附于凝膠，然后用0.1 mol/L鹽水洗2次，最后用0.3 mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒，將病毒較好地回收于水相中。 紅細(xì)胞吸附法(熟悉)n用于某些與紅細(xì)胞吸附的病毒的濃縮n選擇適宜的動(dòng)物紅細(xì)胞：雞紅細(xì)胞n基本步驟：1) 1%-3%的紅細(xì)胞與病毒懸液混合，2吸附1h以上； 2) 1000 r/min 離心10分鐘，沉淀吸附病毒的紅細(xì)胞，棄上清，生理鹽水洗滌2次； 3) 用1/50原體積的磷酸緩沖液重懸紅細(xì)胞沉淀，在37保溫2-3h； 4) 1000 r/

6、min 離心10分鐘，上清即是濃縮的病毒懸液。葡聚糖柱層析法(熟悉)n葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。n最常見的是Sephadex 系列，主要型號(hào)是G-10 G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 干膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干膠。 葡聚糖柱層析法(熟悉)nSephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號(hào)的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。 G-25 分離范圍 1000-5000 適用于脫鹽、肽與其它小分子的分離； G-200 分離范圍

7、5000-600000 適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數(shù)測定。 葡聚糖柱層析法n將初步濃縮的材料，通過葡聚糖G150或G200柱層析，然后用0.020.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.6)洗脫，分部收集，測定280nm波長處的OD值，滴定各部分的效價(jià)，將含病毒的各部分相混合，再濃縮，透析之后，即可得到比較純的病毒。nNagano(1989年)用Sephacryls-1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒。 葡聚糖柱層析法差速離心法(掌握)n原理：不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度n適合分離沉降速度差別較大的粒子n適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細(xì)胞吸附-釋放的病毒懸液中

8、提純病毒。n優(yōu)點(diǎn)：能迅速處理大量樣品，作為病毒提純精制的第一步n常用方法(熟悉)：以低速(2000-3000 r/min)及中速(10000 r/min)離心20-30分鐘去除較大的宿主細(xì)胞碎片、污染的細(xì)菌及其它較大的雜質(zhì)，再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。差速離心法密度梯度離心n原理：將樣品加在惰性密度梯度介質(zhì)上進(jìn)行超速離心，在一定的離心力下把樣品顆粒分配到密度梯度介質(zhì)中相等密度層中，吸出目的顆粒所在的介質(zhì)層，從而達(dá)到分離純化的目的。n常用的介質(zhì)為氯化銫CsCl、蔗糖 1040蔗糖密度梯度制備 n首先配置好不同百分比(w/v)的蔗糖溶液，然后在離心管中先加入濃度最?。?0%）的溶液，然后

9、用吸管加入濃度稍大的溶液，注意，加時(shí)吸管要插入離心管的底部，緩慢加入，務(wù)求界面分明。然后按上法依次分層加入其余各濃度的蔗糖溶液，即可配成蔗糖梯度液。n將事先用更低密度蔗糖溶液（小于10%）懸浮的樣品輕輕加入10%蔗糖溶液的表面，進(jìn)行密度梯度離心即可。梯度混合儀等密度梯度離心(掌握)n原理：與密度梯度法相同，但不制備梯度介質(zhì)，而是在樣品中加入CsCl，離心過程中CsCl隨離心力而下沉，形成連續(xù)密度梯度，樣品中顆粒隨其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯層中。n每毫升病毒懸液加1g的CsCl，混勻，40000g離心24-36h。病毒蛋白的分離SDS-PAGEnPAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳 Poly-A

10、crylamide Gel Electrophoresis 以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳n聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。n催化聚合的常用方法：化學(xué)聚合法?；瘜W(xué)聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。連續(xù)與不連續(xù)PAGEPAGE按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中

11、緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。 不連續(xù)PAGEn不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳，它由濃縮膠和分離膠兩部分所組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度的凝膠上進(jìn)行分離。n樣品顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較連續(xù)電泳系統(tǒng)佳。SDS-PAGEnSDS：十二烷基磺酸鈉 (重點(diǎn))SDS是陰離子去垢劑，使蛋白質(zhì)變性解聚，并與蛋白質(zhì)結(jié)合成帶強(qiáng)負(fù)電荷的復(fù)合物，掩蓋了蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異，使各種蛋白質(zhì)的電荷質(zhì)量比值都相同

12、，因而在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。SDS-PAGEn也稱變性PAGEn通常采用不連續(xù)垂直型系統(tǒng) 濃縮膠、分離膠濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠首次應(yīng)用SDS-PAGE的論文(了解)nLaemmli UK (1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟(熟悉)1、清洗、烘干、組裝 電泳器材SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟2、1%瓊脂封底SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟3、配制分離膠SDS-PA

13、GE實(shí)驗(yàn)步驟4、灌注分離膠灌注完后，加水覆蓋隔絕空氣，同時(shí)可使界面平整一般20-30分鐘凝固SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟5、配制、灌注濃縮膠，插上梳子SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟5、往電泳槽加電泳緩沖液，上樣2上樣緩沖液(樣品溶解液 Loading Buffer)：SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚藍(lán)，Tris-HCl緩沖溶液。蛋白樣品與上樣緩沖液1:1混合，沸水浴3分鐘，離心，上樣其中一個(gè)上樣孔：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)n電泳緩沖液(電極緩沖液)包含SDSn一般配制成10或5SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟6、連接電源，電泳開始SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟7、電泳結(jié)束，剝膠，染色，脫色染色液：考馬斯亮藍(lán)； 銀染法用硝酸銀脫色液

14、：甲醇/異丙醇+醋酸按下式計(jì)算相對(duì)遷移率： 每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分子量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。= 蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm 相對(duì)遷移率8、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測定(重點(diǎn)) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000200,000之間時(shí)，樣品的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 為蛋白質(zhì)的分子量，m R 為相對(duì)遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，b與K均為常數(shù) 因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可

15、以得出未知蛋白的分子量SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟8、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測定 蛋白質(zhì)電泳 常用的SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì) 非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì) 未聚合的聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，未聚合的聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套操作時(shí)要戴手套Western Blot 蛋白質(zhì)鑒定nSouthern Blot：DNAnNorthern Blot：RNAnWestern Blot：單向電泳后的蛋白質(zhì)印跡nEastern Blot：雙向電泳后的蛋白質(zhì)印跡Edwin Mellor SouthernWestern Blot 蛋白質(zhì)鑒定n原理(重點(diǎn)掌握)：將SDS-PAGE上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)

16、移到硝酸纖維素膜上，讓第一抗體與膜上的目的蛋白質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合，然后用經(jīng)過特定酶標(biāo)記的第二抗體結(jié)合第一抗體，加入酶的顯色底物即可檢測的目的蛋白條帶存在與否。Western Blot 步驟(熟悉)n1、SDS-PAGE電泳結(jié)束后，不染色，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，把SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝膠和膜的放置方向) Western Blot 步驟2、膜的染色 (麗春紅、氨基黑) 判斷凝膠上的蛋白是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上； 記錄蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)/樣品的位置；Western Blot 步驟n3、磷酸緩沖液漂洗，進(jìn)行膜的脫色n4、膜的封閉 封閉是用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)封閉膜上未被占據(jù)的表面，使

17、抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有牛血清白蛋白BSA，脫脂奶粉等，一般用脫脂奶粉。 將膜浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。 Western Blot 步驟n5、結(jié)合一抗 (與目的蛋白結(jié)合) 將膜轉(zhuǎn)移到含一抗的封閉液中，室溫下輕搖孵育一小時(shí)。緩沖液洗滌三次 6、一抗與二抗結(jié)合 二抗是一抗的抗體 如果一抗是通過免疫兔子制備，即選擇抗兔的二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。 緩沖液洗滌三次Western Blot 步驟n7、顯色 (1)生物素-親合素系統(tǒng) 生物素(biotin)標(biāo)記二抗，生物素容易與親和素(avidin)結(jié)合,而親和素事先已進(jìn)行酶標(biāo)記，如過氧化物酶，則形成 生物素-親和素

18、-過氧化物酶復(fù)合物 加入底物，即可顯色Western Blot 步驟n7、顯色 (2) 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) HRP經(jīng)過碘酸鈉氧化而標(biāo)記到二抗， 顯色底物：二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、氯萘酚和氨乙基咔唑等。病毒的保存(掌握)n1、低溫及超低溫保存法 低溫(-20-60)、超低溫(-70以下)冰箱 液氮罐(-150-196) 溫度越低，保存時(shí)間越長； 常用保護(hù)劑：脫脂牛奶、5%蔗糖、血清 用保護(hù)劑配制病毒懸液或與病毒懸液混合病毒的保存n2、冷凍干燥保存 原理：微生物懸液冷凍后，在真空中使水分由固體直接升華為氣體，在低溫、干燥和缺氧環(huán)境下，微生物的生長和代謝暫時(shí)停止，因此保存期較長，便于運(yùn)輸。病毒的保存n2、冷凍干燥保存 保護(hù)劑：脫脂牛奶或血清 保護(hù)劑作用原理：在冷凍干燥的脫水過程中穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu)，防止病毒受冷凍或干燥而造成損傷。2、冷凍干燥保存步驟n(1) 準(zhǔn)備安瓿管(高壓滅菌后備用)2、冷凍干燥保存步驟n(2) 制備保護(hù)劑：脫脂牛奶取市售新鮮、清潔、無抗生素污染的牛奶2