核酸提取與鑒定學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1核酸核酸(h sun)提取與鑒定提取與鑒定第一頁，共55頁。 核酸(h sun)的提取與鑒定第一節(jié) 預(yù)處理 第二節(jié) DNA的提取(tq) 第三節(jié) RNA的提取(tq) 第四節(jié) 核酸的鑒定 概述 第1頁/共54頁第二頁，共55頁。研究研究(ynji)對象：基因組對象：基因組DNA、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA、總、總RNA、mRNA過程過程(guchng)： 裂解：破碎裂解：破碎(p su)(p su)細胞，使細胞中的核酸細胞，使細胞中的核酸游離在裂解體系中游離在裂解體系中 純化：純化：使核酸與其它雜質(zhì)徹底分離，如使核酸與其它雜質(zhì)徹底分離，如蛋白質(zhì)、鹽等蛋白質(zhì)、鹽等 總原則：總原則：應(yīng)保證核酸一級結(jié)

2、構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鑒定：鑒定：濃度、純度、分子量、測序濃度、純度、分子量、測序 （技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)等）（技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)等）第2頁/共54頁第三頁，共55頁。 （一）樣品預(yù)處理（獲取分散（一）樣品預(yù)處理（獲取分散(fnsn)細胞細胞） 搗碎(do su)或剪碎；加液氮研磨成粉狀。第3頁/共54頁第四頁，共55頁。2、動物(dngw)樣品新鮮樣品，生理鹽水洗，直接使用新鮮樣品，生理鹽水洗，直接使用(shyng)（或分裝、或分裝、-70/液氮低溫保存）；液氮低溫保存）；甲醛固定組織甲醛固定組織要先去掉甲

3、醛；石蠟包埋組織石蠟包埋組織要經(jīng)過組織切片和二甲苯脫蠟等處理。第4頁/共54頁第五頁，共55頁。來源來源(liyun)：新鮮血液或者凍貯血液；：新鮮血液或者凍貯血液；抗凝劑：抗凝劑：一般用EDTA-Na2或檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉 ），不可使用肝素；肝素；分離：分離：紅白細胞，一般用明膠，加緩沖液懸浮白細胞。（血清（血清DNA是研究腫瘤的材料之一）是研究腫瘤的材料之一）第5頁/共54頁第六頁，共55頁。3、微生物培養(yǎng)物樣品離心(lxn)獲取菌體細胞，加緩沖液洗滌，加緩沖液懸浮菌體細胞。4、微生物混合樣品用緩沖液懸浮菌體，低速離心，沉淀雜質(zhì)。高速(o s)離心獲取菌體細胞。用緩沖液洗

4、滌菌體細胞。加緩沖液懸浮菌體細胞。 第6頁/共54頁第七頁，共55頁。1 1、DNADNA提取用具的處理提取用具的處理 要求無菌；試劑、器材要求無菌；試劑、器材(qci)(qci)高高壓干燥等進行無壓干燥等進行無DNADNA酶處理。酶處理。2 2、RNARNA提取用具提取用具(yngj)(yngj)的處的處理理要求無菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase無處不在且耐高溫，提取條件要求嚴格。第7頁/共54頁第八頁，共55頁。裂解裂解(li ji)細胞，溶出細胞，溶出DNA除去除去(ch q)雜質(zhì)雜質(zhì)重新溶解重新溶解DNA沉淀、濃縮沉淀、濃縮DNA第8頁/共54頁第九頁，共55頁

5、。 破碎細胞，溶解破碎細胞，溶解(rngji)DNA(rngji)DNA：用提取液（裂解液）破壞細胞壁、細胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破壞細胞壁、細胞膜和核膜。微生物樣品提取液：含表面活性劑微生物樣品提取液：含表面活性劑SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等動物樣品提取液：含動物樣品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物樣品提取液：含植物樣品提取液：含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+等激活，提取液均含有螯合劑（如等激活，提取液均含有螯合劑（如EDTAEDTA，檸，檸檬酸等），螯合這些離子。檬酸等），螯合這些離子。第9頁/共54頁第十頁，共55頁。

6、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第10頁/共54頁第十一頁，共55頁。3.沉淀DNA有機溶劑沉淀DNA：2倍體積無水乙醇（或1倍體積的異戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新(chngxn)溶解DNA將DNA溶于水或TE溶液。第11頁/共54頁第十二頁，共55頁。qCTABCTAB法原理（植物法原理（植物DNADNA提取提取(tq)(tq)經(jīng)經(jīng)典方法）典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。與核

7、酸形成復(fù)合物。 該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖(du tn)、酚類等雜質(zhì)后、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出(xch)，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。第12頁/共54頁第十三頁，共55頁。q SDS法原理法原理(yunl) SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能）條件下能裂解細胞裂解細胞(xbo)，使染

8、色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的水相中的DNA。第13頁/共54頁第十四頁，共55頁。DNA提取的一般提取的一般(ybn)流程流程第14頁/共54頁第十五頁，共55頁。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA特點：特點：（1 1）細菌基因）細菌基因(jyn)(jyn)組組DNADNA以外的小型閉合環(huán)狀雙鏈以外的

9、小型閉合環(huán)狀雙鏈DNADNA分分子。子。（2 2）大都含有抗生素抗性基因）大都含有抗生素抗性基因(jyn)(jyn)。（3 3）可自我復(fù)制或表達。（重組）可自我復(fù)制或表達。（重組DNADNA技術(shù)中構(gòu)建載體）技術(shù)中構(gòu)建載體）（4 4）大?。┐笮?-300 kb1-300 kb。第15頁/共54頁第十六頁，共55頁。1 1、培養(yǎng)、培養(yǎng)(piyng)(piyng)細菌和擴增細菌和擴增質(zhì)粒質(zhì)粒n 加適當(dāng)?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀?，抑制細菌蛋白加適當(dāng)?shù)囊种苿ㄈ缏让顾兀种萍毦鞍踪|(zhì)合成，抑制細胞分裂，但質(zhì)粒會繼續(xù)質(zhì)合成，抑制細胞分裂，但質(zhì)粒會繼續(xù)(jx)復(fù)復(fù)制。制。 第16頁/共54頁第十七頁，共55頁。

10、2 2、收獲、收獲(shuhu)(shuhu)細菌和溶細菌和溶菌菌 離心收集細菌細胞。離心收集細菌細胞。 細菌裂解細菌裂解(li ji)(li ji)方法：方法： 機械法機械法 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法 （SDSSDS） 溶菌酶化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）溶菌酶化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）第17頁/共54頁第十八頁，共55頁。3 3、分離、分離(fnl)(fnl)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA基因組基因組DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA分離分離(fnl)(fnl)堿裂解法（最常用堿裂解法（最常用(chn (chn yn)yn)） 用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）懸浮菌體。）懸浮菌體。 溶液溶液2 2（Na

11、OHNaOH和和SDSSDS）裂解菌體，蛋白質(zhì)與）裂解菌體，蛋白質(zhì)與DNADNA發(fā)生變性。發(fā)生變性。 溶液溶液3 3中和中和pHpH，質(zhì)粒，質(zhì)粒DNADNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，基分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，基因組因組DNADNA不復(fù)性與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀。不復(fù)性與蛋白質(zhì)形成絮狀沉淀。 離心后，質(zhì)粒離心后，質(zhì)粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。第18頁/共54頁第十九頁，共55頁。 通過加熱，使細菌裂解、蛋白質(zhì)和通過加熱，使細菌裂解、蛋白質(zhì)和DNADNA變性。變性。 降低溫度，質(zhì)粒降低溫度，質(zhì)粒DNADNA復(fù)性留于上清液，基因組復(fù)性留于上清液，基因組DNADNA復(fù)性很慢與蛋復(fù)性

12、很慢與蛋白質(zhì)形成沉淀白質(zhì)形成沉淀(chndin)(chndin)，可通過離心除去。，可通過離心除去。煮沸裂解法（偶爾煮沸裂解法（偶爾(u r)(u r)用）用）梯度梯度(t d)(t d)離心法（極離心法（極少用）少用） 基因組基因組DNADNA斷裂，吸附大量斷裂，吸附大量EBEB，密度大；質(zhì)粒，密度大；質(zhì)粒DNADNA密度小。密度小。 利用氯化銫梯度離心，分離基因組利用氯化銫梯度離心，分離基因組DNADNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNADNA。第19頁/共54頁第二十頁，共55頁。4 4、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化(chn hu)(chn hu)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第20

13、頁/共54頁第二十一頁，共55頁。所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎(p su)；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。第21頁/共54頁第二十二頁，共55頁。第22頁/共54頁第二十三頁，共55頁。第23頁/共54頁第二十四頁，共55頁。第24頁/共54頁第二十五頁，共55頁。第25頁/共54頁第二十六頁，共55頁。第26頁/共54頁第二十七頁，共55頁。第27頁/共54頁第二十八頁，共55頁。3 3、氯化鋰、氯化鋰- -尿素

14、尿素(nio s)(nio s)法法 利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時抑制RNA酶； 氯化鋰選擇性沉淀RNA。 其缺點是有時會存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會丟失一些小分子RNA。第28頁/共54頁第二十九頁，共55頁。第29頁/共54頁第三十頁，共55頁。5 5、試劑盒快速、試劑盒快速(kui s)(kui s)提取法提取法第30頁/共54頁第三十一頁，共55頁。TRIzol的主要成分是異硫氰酸胍和苯酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細胞(xbo)，使細胞(xbo)中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活

15、性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。第31頁/共54頁第三十二頁，共55頁。1）實驗前取冰，）實驗前取冰，4離心機預(yù)冷，離心機預(yù)冷，DEPC處理水（高壓處理水（高壓(goy)滅菌處理）配制的滅菌處理）配制的75%乙醇乙醇4預(yù)冷；預(yù)冷；2）1ml Trizol勻漿勻漿(yn jin)好的樣品；好的樣品；3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，顛倒顛倒混勻（混勻（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋白變性，氯仿使蛋白變性4）室溫室溫，靜置，靜置3分鐘分鐘；5）離心機）離心機4、14000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心15分鐘分鐘；靜置；靜置1分鐘分鐘（分層（分層即可；樣品

16、會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，即可；樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中）6）取上清取上清0. 5ml（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點也（注意：取最上層水相，小心污染，寧可吸少點也不要吸到中間層的物質(zhì)）不要吸到中間層的物質(zhì)）放入另一個放入另一個1.5ml的的EP管中；管中；7）加入等體積的）加入等體積的異丙醇異丙醇（0.5ml），渦旋混勻；），渦旋混勻；第32頁/共54頁第三十三頁，共55頁。8）室溫，靜置）室溫，靜置10分鐘（該條件由分鐘（該條件由Trizol試劑盒提供；其他試劑盒提供；其他(qt)提供的條件

17、用提供的條件用-20、1小時，目的為了更好分層）小時，目的為了更好分層）9）離心）離心(lxn)機機4、14000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分，離心分，離心(lxn)10分鐘分鐘10）棄上液）棄上液(移液器調(diào)至移液器調(diào)至1ml，分兩步快速輕輕吸棄上清：第，分兩步快速輕輕吸棄上清：第1步步，沿液面吸棄約，沿液面吸棄約0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸棄其余步，沿液面吸棄其余(qy)上清上清;注注意吸頭不要接觸到沉淀斑區(qū)）意吸頭不要接觸到沉淀斑區(qū)）11)沿試管內(nèi)壁輕輕加入沿試管內(nèi)壁輕輕加入1ml 4預(yù)冷的預(yù)冷的75%乙醇乙醇,注意切勿沖擊注意切勿沖擊到沉淀斑區(qū)到沉淀斑區(qū)12）離心機）離心機4、10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分

18、，離心分，離心5分鐘分鐘13）棄上液棄上液（用槍把里面的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過（用槍把里面的乙醇吸去，留極少許即可，以防干燥過程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒溫箱干燥恒溫箱干燥5分鐘分鐘（注意：打開管蓋；或用真（注意：打開管蓋；或用真空干燥空干燥5分鐘）分鐘）14）加入）加入50l DEPC處理水處理水溶解溶解（可以根據(jù)管底的白色沉淀判斷（可以根據(jù)管底的白色沉淀判斷RNA量的多少加量的多少加DEPC處理水）處理水）15）-80冰箱保存。冰箱保存。第33頁/共54頁第三十四頁，共55頁。第34頁/共54頁第三十五頁，共55頁。第35頁/共54頁第三十六頁，共55頁。OD260

19、1時（比色皿厚度時（比色皿厚度(hud)1.0cm）雙鏈雙鏈DNA濃度為濃度為50 g/ml，單鏈單鏈DNA或或RNA濃度為濃度為40 g/ml。DNA(g/ml) = OD26050RNA（g/ml ） = OD26040第36頁/共54頁第三十七頁，共55頁。DNA樣品：樣品：OD260 / OD280 1.8 ，DNA純度高純度高OD260 / OD280 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降部分降解解(jin ji)OD260 / OD280 1.8，含苯酚或蛋，含苯酚或蛋白雜質(zhì)白雜質(zhì)RNA樣品：樣品： OD260 / OD280 1.82.0 RNA純度高純度高 2.0，RNA出

20、現(xiàn)降出現(xiàn)降解解(jin ji)第37頁/共54頁第三十八頁，共55頁。 凝膠上RNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應(yīng)該清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三條帶，其中(qzhng)28s rRNA的亮度應(yīng)為18s rRNA的兩倍，5s rRNA 較弱。 電泳：帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移。第38頁/共54頁第三十九頁，共55頁。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸多用于鑒定較大核酸(h sun)片段（片段（0.160 kb）聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸用于鑒定較小的核酸(h sun)片段（片段（501000 bp）六、電泳六、電泳(din yn)第