骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機制中作用的研究

1、骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機制中作用的研究作者：#目 錄Contents一前言二材料和方法四結(jié)論三結(jié)果一 前言目 錄Contents二 材料與方法三 結(jié)果四 結(jié)論又稱為Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴細(xì)胞活化因子)，是一種多功能的胞外基質(zhì)蛋白，表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中；有兩種形式：分泌型骨橋蛋白(sOPN)和胞內(nèi)型骨橋蛋白(iOPN)；早期研究發(fā)現(xiàn)，OPN能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但在不同的環(huán)境中OPN的作用可能會表現(xiàn)出不同的側(cè)重。骨橋蛋白(OPN)研究背景累及全消化道的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病；病因和發(fā)病機制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)

2、病中起重要作用；研究發(fā)現(xiàn)，OPN在炎癥性腸病患者發(fā)炎的腸道組織中的表達(dá)增加。炎癥性腸?。↖BD）對患者會產(chǎn)生何種影響？問題目 錄Contents一 前言二 材料與方法三 結(jié)果四 結(jié)論研究目的（1）采用IBD小鼠模型實驗觀察OPN缺失對小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎的影響（2）研究骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論研究對象1野生型(WT)小鼠48只2白介素-10基因敲除(IL-10KO)小鼠74只3骨橋蛋白基因敲除(OPNKO)小鼠24只4骨橋蛋白/白介素-10雙敲除(OPN/IL-10DKO)小鼠74只注選用3-12周的雌鼠。所有的小鼠在實驗監(jiān)控

3、期間都經(jīng)確診不攜帶仙臺病毒，肝炎病毒，先天性腳趾不全畸形病毒，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，霉?jié){菌，毛發(fā)樣梭狀芽孢桿茵，庫氏棒桿菌和沙門氏菌。臨床癥狀臨床評分標(biāo)準(zhǔn)目 錄Contents體重下降超過5%脫肛腹瀉二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論對IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠的臨床癥狀表現(xiàn)進(jìn)行評分。出現(xiàn)該臨床癥狀計1分，否則為0。合計得出總分。肛周粘液分泌物目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟患結(jié)腸炎小鼠患結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸結(jié)腸組織組織切片微觀分析切片微觀分析基因表達(dá)定量分析基因表達(dá)定量分析熒光原位雜交技術(shù)（熒光原位雜交技術(shù)（FISHFISH）檢

4、測分泌的磷蛋白檢測分泌的磷蛋白1 1基因編碼基因編碼區(qū)區(qū)OPNOPN酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法量化上清液中量化上清液中TNF-TNF-、IL-6IL-6、IL-12p40IL-12p40含量含量小鼠腸粘膜固有層單個小鼠腸粘膜固有層單個核細(xì)胞的分離核細(xì)胞的分離末端限制性片段長度多態(tài)性末端限制性片段長度多態(tài)性分析分析提取小鼠腹腔巨噬細(xì)提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞胞分析分析吞噬作用吞噬作用腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類的鑒別鑒別統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析( (非參數(shù)非參數(shù)Mann-Whitney U Mann-Whitney U 檢驗或檢驗或BonferroniBonferroni校正單向分析校正單向分

5、析) )87654321910小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞的小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞的準(zhǔn)備和刺激準(zhǔn)備和刺激目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.提取mRNA（異硫氰酸胍-酚氯仿法）；2.進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶）；3.分析互補DNA對GAPDH，IL-6，IFN-，IL-17A和CD11bmRNA的表達(dá)（LightCycler480SystemII）；4.目的基因以GAPDH為參照標(biāo)準(zhǔn)?；虮磉_(dá)定量分析GAPDH5-CAACTTTGTCAAGCTCATTTCC-3(正)5-GGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3(反)IL-65-AGT

6、CCGGAGAGGAGACTTCA-3(正)5-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3(反)IFN-5-AGCTCTTCCTCATGGCTGTT-3(正)5-ATCTGGCTCTGCAGGATTTT-3(反)IL-17A5-TCTCTGATGCTGTTGCTGCT-3(正)5-CGTGGAACGGTTGAGGTAGT-3(反)CD11b5-GCTCCGGTAGCATCAACAAC-3(正)5-AGTGAATCCGGAACTCGTCCG-3(反)引物序列目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.小鼠股骨和脛骨骨髓中提取骨髓細(xì)胞；2.含10%熱滅活的胎牛血

7、清，100mg/ml鏈霉素，100mg/ml青霉素和40ng/ml重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子RPMI1640培養(yǎng)液中37C培養(yǎng)5天；3.衍生的巨噬細(xì)胞按5105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，經(jīng)10ng/mlIFN-隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK450-500ng/ml、LPS100ng/ml、ODN1585500nM）刺激細(xì)胞24h；4.吸取上清液-80冷凍保存?zhèn)溆?。小鼠骨髓巨噬?xì)胞的準(zhǔn)備和刺激目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.小鼠結(jié)腸組織切片，PBS沖洗；2.含5mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇漢克平衡鹽緩沖液中去除上皮細(xì)胞；3.含0.5mg/

8、ml膠原酶D、0.5mg/mlDNA酶I、3mg/mlDispaseIIPBS中用37搖床孵育30分鐘慢速旋轉(zhuǎn)，棄上清用40%的Percoll分離液重懸，80%Percoll分離液覆蓋；4.離心后即可在兩層Percoll液的界面上獲取LPMCs，PBS洗滌5.LPMCs中提取RNA小鼠腸粘膜固有層單個核細(xì)胞的分離目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.小鼠盲腸置于含100mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH9.0)、40mM乙二胺四乙酸、4M硫氰酸胍0.001%溴麝香草酚藍(lán)的溶液中，分解懸浮物中的糞便，提取糞便DNA；2.5-FAM-labeled516f和1

9、510r作引物從糞便DNA中生成16srRNA擴增子，10UofBsll處理3小時，ABIPRISM3130 xl基因分析儀進(jìn)行分餾；3.OTUs分析13bp長度末端限制性片段，得到T-RFLP文件，進(jìn)行主成分分析。末端限制性片段長度多態(tài)性分析目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.小鼠腹腔注射3mL4%巰乙酸，第4天獲取腹膜滲出細(xì)胞。去除紅細(xì)胞，使用抗CD11b磁珠選擇CD11b陽性thioglycollate誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞(TEPMs)；2.TEPMs按2.5105個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)含40ng/ml重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子的RPMI1

10、640中隔夜孵化，PBS清洗，在這些孔中，分別增加重組OPN濃度1,10,100,1000ng/ml，細(xì)胞在37C培養(yǎng)；3.在活細(xì)胞成像溶液中用熒光粒子稀釋,用熒光酶標(biāo)儀在指定時間測量熒光強度。4.所有實驗孔中，通過減弱陰性對照孔平均熒光強度評估吞噬活性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取和吞噬作用分析目 錄Contents二 材料與方法一 前言三 結(jié)果四 結(jié)論實驗方法與步驟1.在無菌條件下獲得MLNs，提取細(xì)菌DNA；2.通用引物(27F；5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,1492R；5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)擴增細(xì)菌的16srRNA，內(nèi)引物(35F；5-CCTGGC

11、TCAGGATGAACG-3；519R；5-ATTACCGCGGCKGCTC-3)擴增巢式PCR；3.1%瓊脂糖凝膠電泳擴增產(chǎn)物，用QIAEXII凝膠萃取設(shè)備提純，綁定到PCR4-TOPO載體，使用TOPO-TA克隆工具將其轉(zhuǎn)變?yōu)镋.coliTOP10細(xì)胞;4.TempliPhi系統(tǒng)擴增16SrRNA基因，用作DNA測序模板。ABI3730DNA分析儀進(jìn)行分析，從日本DNA數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)所有條目，BLAST分析檢查所有的核苷酸序列，用DNA序列分析軟件進(jìn)行匹配。腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類(MLNs)的鑒別目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論OPN KO小鼠沒有出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎O

12、PNKO小鼠直腸組織HE-染色劑圖像WT小鼠和IL-10KO小鼠直腸組織OPN基因的表達(dá)IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠臨床得分隨時間的變化情況OPN缺失導(dǎo)致IL-10 KO小鼠結(jié)腸中合成OPN mRNA增多OPN/IL-10 DKO小鼠表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠組織學(xué)得分變化情況（左）和4周齡直腸組織HE-染色劑圖像（右）4周齡IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠結(jié)腸組織IL-6、IFN-和IL-17A基因表達(dá)OPN/IL-10 DKO小鼠很快發(fā)生結(jié)腸炎，而在4周齡發(fā)生免疫細(xì)胞浸

13、潤增多和顯著的直腸上皮增生OPN/IL-10 DKO小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)比IL-10 KO小鼠多目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論4周齡的WT、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠直腸組織OPNmRNAFISH圖像IL-10 KO小鼠直腸組織合成OPN mRNA更多4周齡IL-10KO小鼠直腸組織OPNmRNAFISH圖像(紅)E-cadherin免疫熒光染色(綠)IL-10 KO小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞OPN的合成增多目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論3周齡IL-10KO小鼠和OPN/IL-10DKO小鼠糞便樣本T-RFL

14、P數(shù)據(jù)主要成分分析T-RFLP數(shù)據(jù)IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠腸道細(xì)菌組成有明顯差異OPN/IL-10 DKO小鼠有更低豐度的梭狀芽孢桿菌亞群XIVa和更高豐度的梭狀芽孢桿菌XVIII 目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠結(jié)腸組織CD11b基因表達(dá)刺激物刺激WT、OPNKO、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠產(chǎn)生BMDMs細(xì)胞因子數(shù)量IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠LPMCs中NOS2,TNF-,andIL-12p40基因的表達(dá)OPN能影響巨噬細(xì)胞的活動目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論WT、OPNKO、IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠在E.Coli熒光共軛粒子作用后TEPMs熒光強度的變化情況OPNKO小鼠在E.Coli熒光共軛粒子作用TEPMs熒光強度的變化情況OPN能影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能目 錄Contents三 結(jié)果二 材料與方法一 前言四 結(jié)論3周齡IL-10KO和OPN/IL-10DKO小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌種類相比IL-10 KO小鼠，OP