免疫檢測技術

1、會計學1免疫檢測技術免疫檢測技術網(wǎng)格學說網(wǎng)格學說（lattice theory）抗體過剩抗體過?？乖^?？乖^?？贵w抗體比例合適抗體抗體比例合適抗原抗原抗體抗體1.沉淀反應沉淀反應2.凝集反應凝集反應3.補體參與的反應補體參與的反應4.中和反應中和反應5.免疫標記技術免疫標記技術絮狀沉淀絮狀沉淀環(huán)狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫濁度沉淀絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗操作步驟：操作步驟：（1） 將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2） 各管加入一定濃度的適量抗血清。各管加入一定濃度的適量抗血清。（3） 振搖使抗原、抗體充分混勻，置振搖使抗原、抗體充分混勻，置37孵育。孵育。（4

2、） 產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。為最適比例管。 絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，目前目前多用以測定抗原抗體反應的最適比多用以測定抗原抗體反應的最適比。環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗免疫電泳原理圖解免疫電泳原理圖解 顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相應抗體，在適當電解顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相應抗體，在適當電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應。稱為凝集反應。 加入標準量補體加入標準量補體 加

3、入包被抗體的紅細胞加入包被抗體的紅細胞 檢測紅細胞溶解情況檢測紅細胞溶解情況AgPatientsserum AbNo AbAg常見標記免疫技術常見標記免疫技術放射免疫技術放射免疫技術酶免疫技術酶免疫技術熒光免疫技術熒光免疫技術 放射免疫分析基本原理放射免疫分析基本原理競爭性結(jié)合反應的經(jīng)競爭性結(jié)合反應的經(jīng)典標記抗原（典標記抗原（AgAg* *）和）和非標記抗原（非標記抗原（AgAg）與限）與限量抗體量抗體(Ab)(Ab)競爭性結(jié)合競爭性結(jié)合AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的與與AbAb結(jié)合能力結(jié)合能力 Ag* Ab Ag 標記抗原標記抗原 特異性抗體特異性抗體 待測抗原待測抗原( A

4、g*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復合物抗原抗體復合物分離分離Ag*-Ab 和游離和游離Ag*從標準曲線上讀知含量從標準曲線上讀知含量 測定測定Ag*-Ab和游離和游離Ag*放射性放射性 放射免疫測定法放射免疫測定法(RIA)示意圖示意圖 7550 30 100110100 1000未標記抗原濃度（未標記抗原濃度（ng/mL)結(jié)合結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（未結(jié)合的放射活性（%）Ag*-AbAg*Ag熒光素標記的熒光素標記的特異性抗體特異性抗體組織切片組織切片Ag熒光素標記熒光素標記的抗抗體的抗抗體組織切片組織切片待測抗體待測抗體免免 疫疫 熒熒 光光 染染 色色 顯顯 示示 細細 胞胞 骨

5、骨 架架 免疫熒光染色是利用抗原抗體特異性結(jié)免疫熒光染色是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)合的原理，用經(jīng)熒光染料標記的抗體熒光染料標記的抗體對細胞對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對法。該技術與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B,

6、Texas Red, Alexa-546,568,594顯示藍色熒光：Alexa350 用Alexa488標記的抗人-tubulin抗體染色顯示微管 ( 綠 色 ) ; 細 胞 核 : 紅 色 , D A P I 染 色人皮膚角化細胞人皮膚角化細胞免疫熒光染色免疫熒光染色用抗-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細胞核: 紅色, DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細胞細胞免疫熒光染色免疫熒光染色固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑）酶標記的抗原或抗體（酶標記的抗原或抗體（標記物）標記物）酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）底物顯色底物顯色定性或定量

7、的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應反應加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標抗原抗原和酶標抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合在固相上使結(jié)合在固相上的抗原抗體復合物的抗原抗體復合物與未結(jié)合的分離與未結(jié)合的分離1234基本步驟基本步驟適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心 020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒試劑盒儀器儀器特殊防護特殊防護治理污染治理污染人民幣人民幣人民幣人民幣三種免疫

8、測定技術的成本及費用三種免疫測定技術的成本及費用A. 將將Ab吸附在固相載體表面吸附在固相載體表面; B. 加入酶標加入酶標Ag和待測和待測Ag，競爭結(jié)合，競爭結(jié)合Ab； 對照只加入酶標對照只加入酶標Ag； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知Ag量。量。3 競爭法測定抗原競爭法測定抗原原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測標本中捕獲待測標本中IgMIgM類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標記特加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 ABS-ELISA法法 ：固相支持物；：固相支持物；：樣品；：

9、樣品；：特異性：特異性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶HRP-HRP-酶標鏈親和素（酶標鏈親和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB顯色液；顯色液；：顯色；：顯色；絮狀沉淀絮狀沉淀環(huán)狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫濁度沉淀放射免疫分析基本原理放射免疫分析基本原理競爭性結(jié)合反應的經(jīng)競爭性結(jié)合反應的經(jīng)典標記抗原（典標記抗原（AgAg* *）和）和非標記抗原（非標記抗原（AgAg）與限）與限量抗體量抗體(Ab)(Ab)競爭性結(jié)合競爭性結(jié)合AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的與與AbAb

10、結(jié)合能力結(jié)合能力 Ag* Ab Ag 標記抗原標記抗原 特異性抗體特異性抗體 待測抗原待測抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復合物抗原抗體復合物分離分離Ag*-Ab 和游離和游離Ag*從標準曲線上讀知含量從標準曲線上讀知含量 測定測定Ag*-Ab和游離和游離Ag*放射性放射性 放射免疫測定法放射免疫測定法(RIA)示意圖示意圖Ag熒光素標記的熒光素標記的特異性抗體特異性抗體組織切片組織切片Ag熒光素標記熒光素標記的抗抗體的抗抗體組織切片組織切片待測抗體待測抗體免免 疫疫 熒熒 光光 染染 色色 顯顯 示示 細細 胞胞 骨骨 架架 免疫熒光染色是利用抗原抗體特異性結(jié)免疫熒光染色是

11、利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)合的原理，用經(jīng)熒光染料標記的抗體熒光染料標記的抗體對細胞對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對法。該技術與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594顯示藍色熒光