定量RTPCR原理

1、競爭性RT-PCR PCR的終產(chǎn)物量取決于靶序列與競爭性序列量的起始比例。 理想情況下，靶序列與參照物以相同的效率擴增，在瓊脂糖凝膠電泳中區(qū)別開。競爭性RT-PCR參照物片段分兩類:- 同源性片段與靶序列只有微小差別- 非同源性片段除兩端引物模板區(qū)以外與靶序列不同競爭性RT-PCR面臨的問題變異主要來源是樣品RNA的純度和完整性，應(yīng)設(shè)內(nèi)源性參照物。若使用DNA參照物，反轉(zhuǎn)錄酶的效率未受控制。RT-PCR定量的條件 確定PCR反應(yīng)曲線上的有效范圍，即在平臺效應(yīng)出現(xiàn)以前PCR擴增得到的終產(chǎn)物與加入的RNA數(shù)量呈線性關(guān)系。 確定足夠的樣品數(shù)，保證可對PCR擴增產(chǎn)物量間差異進行統(tǒng)計分析。非競爭性RT-

2、PCR 目前主要采用熒光實時RT-PCR，放射性標(biāo)記核苷酸的方法已基本淘汰。實時RT-PCR 實時RT-PCR就是在PCR擴增的每一個循環(huán)后分別檢測其PCR產(chǎn)量，借助計算機數(shù)據(jù)處理，可以描繪出PCR擴增循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物變化曲線。 根據(jù)PCR 變化曲線計算出目標(biāo)靶基因分子數(shù)。傳統(tǒng)RT-PCR與實時RT-PCR的流程比較熒光定量RT-PCR基本流程熒光測定的光學(xué)原理圖熒光測定的光學(xué)原理圖濾鏡輪濾鏡輪CCD相機相機光源光源濾光鏡濾光鏡96孔板孔板多元鏡多元鏡雙色鏡雙色鏡夫累舍爾透鏡夫累舍爾透鏡96孔透鏡組孔透鏡組反射鏡反射鏡Molecular Beacon MethodDye Incorpora

3、tion MethodHybridisation Probe MethodTaqmanTaqman熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù)特異性熒光特異性熒光 標(biāo)記探針標(biāo)記探針TaqTaq酶酶 53 53 外切酶活性外切酶活性設(shè)置內(nèi)參照 分為兩種：在擴增反應(yīng)中加入的外源參照物和樣品中正常存在的內(nèi)源參照物。 內(nèi)源性參照物通常使用“管家” 序列或rRNA。實時RT-PCR特點 擴增反應(yīng)處于對數(shù)增長期，無平臺效應(yīng)。 無需處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物，減少污染。 檢測范圍更寬，速度更快。ApplicationQuantificationMutation/Allele detectionMultiplex RT-PC

4、R Detection of mRNA splice variantsMutation/Allele detectionUse different reporter dyesOne increase homozygosityTwo increase heterozygosityMultiplex RT-PCRAdvantage: Time and reagent savingLimitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability多重定量多重定量PCRPCR結(jié)果結(jié)果TNF-, TGF-, TN

5、F-and lymphotoxin-amplifications (FAM)in replicates of 5 18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC) showing all 20 sample wellsDetection of mRNA splice variants主要內(nèi)容主要內(nèi)容1. Taqman探針原理2. CT值和閾值的確定3. ROX內(nèi)參比熒光的作用4. IPC內(nèi)對照的作用退火，開始延伸退火，開始延伸535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQ替換替換53

6、5535ForwardPrimerReversePrimerRQ剪切剪切535535QR延伸結(jié)束延伸結(jié)束535535RQ熒光定量熒光定量PCRPCR實驗熒光強度的計算公式實驗熒光強度的計算公式Rn=總熒光強度RB=基本（空白）熒光強度XO=靶基因起始拷貝數(shù)EX=擴增效率（0 EX 1）n =擴增循環(huán)數(shù)RS=每個熒光分子的熒光強度SnXOBnREXRR)1 ( 達到閾值時的計算公式達到閾值時的計算公式RB, Rs 和 Ex 是確定的Rn=RT=閾值n=CT= 達到閾值時的循環(huán)數(shù)SCXOBTREXRRT)1 ( C CT T的推導(dǎo)過程的推導(dǎo)過程RT =RB+XO(1+Ex)CTRs log(RT

7、-RB)=log XO +CTlog(1+ Ex)+logRsCTlog(1+ Ex)=log(RT -RB)-log XO -logRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXCCT = -k logX0 + bCt起始DNA拷貝數(shù)C CT T值與起始值與起始DNADNA拷貝數(shù)的關(guān)系拷貝數(shù)的關(guān)系Rn (熒光信號)Cycle Number（循環(huán)數(shù)）Threshold（閾值）閾值的作用：確定閾值的作用：確定C CT T值值閾值 = 基線（背景）信號均值基線（背景）信號標(biāo)準(zhǔn)偏差 x 10基線的范圍：從第3個循環(huán)起到指數(shù)增長開始前3個循環(huán)止。一般取3-15循環(huán)。確定閾

8、值的標(biāo)準(zhǔn)：基線確定閾值的標(biāo)準(zhǔn)：基線基線閾值標(biāo)準(zhǔn)偏差3個循環(huán)閾值選擇的推導(dǎo)原理閾值選擇的推導(dǎo)原理1. 基線（空白）信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的2. 偶然誤差的結(jié)果滿足對數(shù)分布3. 閾值 = 基線（背景）信號均值基線（背景）信號標(biāo)準(zhǔn)偏差 x 104. 由于測量的偶然誤差而導(dǎo)致測得的熒光信號大于閾值的概率小于1055. 當(dāng)熒光信號大于閾值時，可以肯定是由于PCR的擴增使得熒光信號強度可以測量得到SampleNo TemplateThresholdBaselineRn+Rn- RnCtPCR PCR 反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線未知樣品標(biāo)準(zhǔn)品：產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)參比（Internal Standard）ROX

9、校正樣品管和加樣誤差內(nèi)對照（Internal Control）：校正擴增效率的誤差+/-對照：檢驗試劑和儀器的可靠性6次重復(fù)：滿足統(tǒng)計學(xué)要求定量準(zhǔn)確的要素定量準(zhǔn)確的要素多色熒光技術(shù)多色熒光技術(shù)準(zhǔn)確的熒光定量要求ROX校正和IPC校正檢材和對照最好在同一反應(yīng)管中，誤差最小多重檢測要求儀器有多種熒光檢測能力只有ABI的儀器才具有四色檢測能力：uFAM：標(biāo)記目的基因探針uVIC：標(biāo)記第二個目的基因或IPC探針uTAMRA：淬滅基團uROX： 內(nèi)參比熒光使用使用ROXROX內(nèi)參比的效果內(nèi)參比的效果使用使用ROXROX內(nèi)參比的好處內(nèi)參比的好處 報告熒光報告熒光參比熒光參比熒光樣品管1樣品管2不使用參比熒

10、光校正的結(jié)果使用參比熒光校正的結(jié)果ROXROX熒光內(nèi)參比的作用熒光內(nèi)參比的作用以固定濃度存在于TaqMan PCR緩沖液中，常用ROX熒光強度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX， Rn = Rn,sample Rn,blank影響熒光信號強度的因素包括：u光纖出口處的激光強度；管蓋厚度、透光性u緩沖液和反應(yīng)體積等校正管間差異，保證實驗結(jié)果的重現(xiàn)性5 Nuclease Multiplex Assay5 Nuclease Multiplex AssayFAM dye labeled 35S TargetVIC dye labeled ER陽性內(nèi)對照陽性內(nèi)對照

11、(IPC)(IPC)為操作方便，取樣一般以克或uL為單位IPC一般選用基因組中單拷貝的管家基因，其定量結(jié)果代表了基因組的數(shù)量，也就是檢材中細胞的數(shù)量。CT = CT Sample - CT IPC將定量結(jié)果校正為以基因組為單位，不同樣品之間具可比性。陽性內(nèi)對照陽性內(nèi)對照(IPC)(IPC)IPC除了用于計算CT，校正定量結(jié)果外，還可以起到陽性對照的作用，用于判斷陰性結(jié)果的真?zhèn)?。u真陰性檢材-；IPC+u假陰性檢材-；IPC-常用的內(nèi)對照：u18S rRNAu-actinuGAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的選擇標(biāo)準(zhǔn)品的選擇標(biāo)準(zhǔn)品可以從ABI購買，也可以自己制備標(biāo)準(zhǔn)品的單位并不重要，取決于對最終結(jié)果的要求：拷貝數(shù)

12、，%，ng/uL, mol/uL如轉(zhuǎn)基因定量的國際標(biāo)準(zhǔn)是%(w/w) ，標(biāo)準(zhǔn)品最好是先將不同重量比的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好DNA，再用水梯度稀釋如果要得出的是樣品中的基因拷貝數(shù)，則梯度稀釋已知摩爾濃度的DNA目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 27 = 27內(nèi)對照用于確認陰性結(jié)果內(nèi)對照用于確認陰性結(jié)果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 40 = 40假陰性結(jié)果假陰性結(jié)果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 29