共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 簡(jiǎn)介以及原理PPT教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1共聚焦激光掃描熒光顯微鏡共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 簡(jiǎn)介以及原簡(jiǎn)介以及原理理 什么是什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？ 共聚焦激光掃描熒光顯微鏡共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作為光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技以激光作為光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)微鏡系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng) 細(xì)胞CT 第1頁/共31頁熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語熒光物質(zhì)： 某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)

2、范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線 熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長(zhǎng))488nm 520nm異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光(EMISSION): 發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長(zhǎng))熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE): 組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)： 熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光

3、的能力逐漸下降并最終喪失 漂白。第2頁/共31頁二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原理熒光顯微鏡激發(fā)濾鏡：激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。 帶通濾色鏡帶通濾色鏡( (BP)BP)：有寬、窄帶之分。如：有寬、窄帶之分。如：BP450-490BP450-490 長(zhǎng)、短通濾色鏡組合長(zhǎng)、短通濾色鏡組合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 雙色鏡：雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過長(zhǎng)波長(zhǎng)。雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過長(zhǎng)波長(zhǎng)。阻斷濾鏡：阻斷濾鏡：多為長(zhǎng)通濾色鏡；多為長(zhǎng)通濾色鏡；LP490LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈

4、被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光學(xué)成像濾鏡分光488nm 520nmFITC450nm 490nm第3頁/共31頁熒光顯微鏡的不足:1.無法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4.無法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.濾鏡對(duì)熒光信號(hào)衰減大,靈敏度熒光強(qiáng)度不夠。6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊7.只能在二維環(huán)境下觀察。8.樣品不能太厚。9.熒光的串繞無法回避。10.放大倍率小。第4頁/共31頁共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置Laserand

5、 electronicControl Unit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocal scan and detector unit 共聚焦掃描及檢測(cè)裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibration table防震臺(tái)Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System第5頁/共31頁第6頁/共31頁第7頁/共31頁第8頁/共31頁第9頁/共31頁第10頁/共31頁第11頁/共31頁第12頁/共31頁第13頁/共31頁第14頁/共31頁第15頁/共31頁第16頁/共31頁第17頁/共31頁第18頁/共31頁第19頁/共31頁第20頁/共31頁第21頁/共31頁第22頁/共31頁第23頁/共31頁光電倍增器雙色鏡激發(fā)和發(fā)射濾波滑動(dòng)器強(qiáng)度調(diào)整密度塔激發(fā)發(fā)射和射柱準(zhǔn)直儀電源X-Y檢流計(jì)鏡掃描控制器出入口透鏡系統(tǒng)第24頁/共31頁第25頁/共31頁第26頁/共31頁第27頁/共31頁第28