重組蛋白質(zhì)藥物純化清潔驗(yàn)證（課堂PPT）

1、LOGO純化清潔驗(yàn)證純化清潔驗(yàn)證 目錄目錄u 清潔驗(yàn)證的定義u 法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求u 清潔驗(yàn)證的前提u 設(shè)備分組u 待清潔成分u 可接受限度u 取樣方法u 取樣點(diǎn)的選擇u 檢驗(yàn)方法u 特殊設(shè)備的清潔驗(yàn)證u 再驗(yàn)證u 偏差與變更控制u 案例分析清潔驗(yàn)證的定義清潔驗(yàn)證的定義u清洗驗(yàn)證是用書面證據(jù)證明批準(zhǔn)的清洗規(guī)程可以對設(shè)備進(jìn)行有效的清洗，并使清洗后的設(shè)備適用于產(chǎn)品的制造或包裝，即設(shè)備內(nèi)表面的殘留物及微生物指標(biāo)達(dá)到清潔要求所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。u通常清潔驗(yàn)證應(yīng)包括以下三個方面： 1、生產(chǎn)結(jié)束至開始清潔的最長時間（也稱待清潔時限）； 2、已清潔設(shè)備用于下次生產(chǎn)前的最長存放時間（也稱清潔效期）； 3、連續(xù)生產(chǎn)

2、最長時間（階段性生產(chǎn)，大小清場）。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求u中國GMP的要求（2010年版）第一百四十三條清潔方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗(yàn)證，證實(shí)其清潔的效果，以有效防止污染和交叉污染。清潔驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)綜合考慮設(shè)備使用情況、所使用的清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置以及相應(yīng)的取樣回收率、殘留物的性質(zhì)和限度、殘留物檢驗(yàn)方法的靈敏度等因素。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求uGMP附件 確認(rèn)與驗(yàn)證第三十八條 為確認(rèn)與產(chǎn)品直接接觸設(shè)備的清潔操作規(guī)程的有效性，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行清潔驗(yàn)證。應(yīng)當(dāng)根據(jù)所涉及的物料，合理地確定活性物質(zhì)殘留、清潔劑和微生物污染的限度標(biāo)準(zhǔn)。第三十九條 在清潔驗(yàn)證中，不能采用反復(fù)清洗至清潔的

3、方法。目視檢查是一個很重要的標(biāo)準(zhǔn)，但通常不能作為單一可接受標(biāo)準(zhǔn)使用。第四十條 清潔驗(yàn)證的次數(shù)應(yīng)當(dāng)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估確定，通常應(yīng)當(dāng)至少進(jìn)行連續(xù)三次。清潔驗(yàn)證計(jì)劃完成需要一定的時間，驗(yàn)證過程中每個批次后的清潔效果需及時進(jìn)行確認(rèn)。必要時，企業(yè)在清潔驗(yàn)證后應(yīng)當(dāng)對設(shè)備的清潔效果進(jìn)行持續(xù)確認(rèn)。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求uGMP附件 確認(rèn)與驗(yàn)證第四十一條 驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)考慮清潔方法的自動化程度。當(dāng)采用自動化清潔方法時，應(yīng)當(dāng)對所用清潔設(shè)備設(shè)定的正常操作范圍進(jìn)行驗(yàn)證；當(dāng)使用人工清潔程序時，應(yīng)當(dāng)評估影響清潔效果的各種因素，如操作人員、清潔規(guī)程詳細(xì)程度（如淋洗時間等），對于人工操作而言，如果明確了可變因素，在清潔

4、驗(yàn)證過程中應(yīng)當(dāng)考慮相應(yīng)的最差條件。第四十二條 活性物質(zhì)殘留限度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)基于毒理試驗(yàn)數(shù)據(jù)或毒理學(xué)文獻(xiàn)資料的評估建立。如使用清潔劑，其去除方法及殘留量應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)考慮工藝設(shè)備鏈中多個設(shè)備潛在的累積效應(yīng)。第四十三條 應(yīng)當(dāng)在清潔驗(yàn)證過程中對潛在的微生物污染進(jìn)行評價(jià)，如需要，還應(yīng)當(dāng)評價(jià)細(xì)菌內(nèi)毒素污染。應(yīng)當(dāng)考慮設(shè)備使用后至清潔前的間隔時間以及設(shè)備清潔后的保存時限對清潔驗(yàn)證的影響。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求uGMP附件 確認(rèn)與驗(yàn)證第四十四條 當(dāng)采用階段性生產(chǎn)組織方式時，應(yīng)當(dāng)綜合考慮階段性生產(chǎn)的最長時間和最大批次數(shù)量，以作為清潔驗(yàn)證的評價(jià)依據(jù)。第四十五條 當(dāng)采用最差條件產(chǎn)品的方法

5、進(jìn)行清潔驗(yàn)證模式時，應(yīng)當(dāng)對最差條件產(chǎn)品的選擇依據(jù)進(jìn)行評價(jià)，當(dāng)生產(chǎn)線引入新產(chǎn)品時，需再次進(jìn)行評價(jià)。如多用途設(shè)備沒有單一的最差條件產(chǎn)品時，最差條件的確定應(yīng)當(dāng)考慮產(chǎn)品毒性、允許日接觸劑量和溶解度等。每個使用的清潔方法都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行最差條件驗(yàn)證。在同一個工藝步驟中，使用多臺同型設(shè)備生產(chǎn)，企業(yè)可在評估后選擇有代表性的設(shè)備進(jìn)行清潔驗(yàn)證。第四十六條 清潔驗(yàn)證方案應(yīng)當(dāng)詳細(xì)描述取樣的位置、所選取的取樣位置的理由以及可接受標(biāo)準(zhǔn)。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求uGMP附件 確認(rèn)與驗(yàn)證第四十七條 應(yīng)當(dāng)采用擦拭取樣和（或）對清潔最后階段的淋洗液取樣，或者根據(jù)取樣位置確定的其他取樣方法取樣。擦拭用的材料不應(yīng)當(dāng)對結(jié)果

6、有影響。如果采用淋洗的方法，應(yīng)當(dāng)在清潔程序的最后淋洗時進(jìn)行取樣。企業(yè)應(yīng)當(dāng)評估取樣的方法有效性。第四十八條 對于處于研發(fā)階段的藥物或不經(jīng)常生產(chǎn)的產(chǎn)品，可采用每批生產(chǎn)后確認(rèn)清潔效果的方式替代清潔驗(yàn)證。每批生產(chǎn)后的清潔確認(rèn)應(yīng)當(dāng)根據(jù)本附錄的相關(guān)要求進(jìn)行。第四十九條 如無法采用清潔驗(yàn)證的方式來評價(jià)設(shè)備清潔效果，則產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)采用專用設(shè)備生產(chǎn)。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求u歐盟GMP的要求 36.為確認(rèn)清潔規(guī)程的效力，應(yīng)進(jìn)行清潔驗(yàn)證。應(yīng)根據(jù)所涉及的物料，合理的確認(rèn)產(chǎn)品殘留、清潔劑和微生物污染的限度標(biāo)準(zhǔn)。這個限度標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是可以達(dá)到的，能夠證實(shí)的。 37.應(yīng)使用經(jīng)驗(yàn)證的、檢出靈敏度高的檢驗(yàn)方法來檢測殘

7、留或污染物。每種分析方法或儀器的檢測靈敏度應(yīng)足以檢測出設(shè)定合格限度水平的殘留或污染物。 38.通常只有接觸產(chǎn)品設(shè)備表面的清潔規(guī)程需要驗(yàn)證。某些場合下，還應(yīng)考慮不直接接觸產(chǎn)品的部分。應(yīng)驗(yàn)證設(shè)備使用與清潔的間隔時間，以及已清潔設(shè)備可保留的時間，并通過驗(yàn)證確定清潔的間隔時間和清潔方法。法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求法規(guī)對清潔驗(yàn)證的要求u歐盟GMP的要求 39.對于相似產(chǎn)品和相似工藝而言，可從相似產(chǎn)品及工藝中，選擇一個具有代表性的產(chǎn)品和工藝進(jìn)行清潔驗(yàn)證?？刹捎谩白畈顥l件”的方法進(jìn)行單獨(dú)的驗(yàn)證試驗(yàn)，在驗(yàn)證中應(yīng)考慮關(guān)鍵因素。 40.為證明方法是經(jīng)過驗(yàn)證的，通常應(yīng)在3個連續(xù)批上使用該清潔規(guī)程，并檢驗(yàn)合格。 41.清潔

8、驗(yàn)證不應(yīng)采用“不斷測試，直至清潔”的方式。 42.如果實(shí)際產(chǎn)品是有毒物質(zhì)或有害物質(zhì)，在清潔驗(yàn)證中，可以例外地采用物化特性相似的無毒無害物質(zhì)來模擬。清潔驗(yàn)證的前提清潔驗(yàn)證的前提u 廠房、設(shè)備、公用系統(tǒng)（水電汽等）經(jīng)過驗(yàn)證（至少含IQ/OQ）。設(shè)備在運(yùn)行確認(rèn)中，已通過核黃素試驗(yàn)、風(fēng)險(xiǎn)評估或其他方法確認(rèn)最難清潔部位。u 生產(chǎn)工藝流程已經(jīng)確認(rèn)。u 清潔規(guī)程已經(jīng)確定，明確四個重要參數(shù)TACT，即清洗時間、清洗動作要求，清洗液濃度，清洗液溫度。有完善的操作說明書。u 相關(guān)記錄已放到現(xiàn)場（操作記錄、取樣記錄）。u 分析方法和檢驗(yàn)儀器經(jīng)過驗(yàn)證。（專屬性，靈敏度，精密度，線性范圍，檢驗(yàn)回收率）u 取樣方法經(jīng)過驗(yàn)

9、證。取樣回收率。對于極易溶于水的殘留，如作為清潔劑的氫氧化鈉，因?yàn)槠淙芏冗h(yuǎn)低于其溶解度，可不必進(jìn)行回收率的研究。根據(jù)PDA TR49，清潔驗(yàn)證并不要求對生物負(fù)載與內(nèi)毒素回收率進(jìn)行研究。u 物料試劑經(jīng)過檢驗(yàn)合格。 u 操作人員經(jīng)過培訓(xùn)，并獲得相應(yīng)資質(zhì)。u 完成實(shí)驗(yàn)性工作。設(shè)備分組設(shè)備分組u 設(shè)備分組可以篩選驗(yàn)證對象，降低不必要和無價(jià)值的驗(yàn)證工作，使驗(yàn)證更有針對性。u 設(shè)備分組應(yīng)考慮是否接觸產(chǎn)品活性成分，是否多產(chǎn)品共用，設(shè)備是否反復(fù)使用，設(shè)備清潔方法（手工清洗、自動清洗），設(shè)備材質(zhì)，設(shè)備結(jié)構(gòu)，設(shè)備規(guī)格。u 設(shè)備分組的策略是基于設(shè)備應(yīng)在設(shè)計(jì)和可清潔性上“相同”或“相似”，“相同”或“相似”的理由，應(yīng)

10、在驗(yàn)證方案中予以清晰的描述。待清潔成分設(shè)備分組設(shè)備分組示例：u 直接接觸產(chǎn)品活性成分，多品種共用的設(shè)備。驗(yàn)證的重點(diǎn)。可以選擇最難清潔的產(chǎn)品進(jìn)行重點(diǎn)驗(yàn)證，其他產(chǎn)品進(jìn)行簡單確認(rèn)。u 直接接觸產(chǎn)品活性成分，品種專用的設(shè)備。u 不接觸產(chǎn)品活性成分的設(shè)備，如接觸緩沖溶液、輔料的設(shè)備。u 一次性使用的設(shè)備。該類設(shè)備不需要清潔驗(yàn)證。二次分組：按照設(shè)備材質(zhì)、設(shè)備結(jié)構(gòu)和清洗方法進(jìn)行二次分組，對于材質(zhì)、結(jié)構(gòu)一致，且清洗方法一樣的設(shè)備，可以選擇規(guī)格最大和規(guī)格最小的設(shè)備進(jìn)行驗(yàn)證，對于其余規(guī)格的設(shè)備最好也進(jìn)行一次簡單的確認(rèn)。設(shè)備分組設(shè)備分組u 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果，結(jié)合設(shè)備選型設(shè)計(jì)的比對，將化學(xué)因素和物理因素進(jìn)行成組比對，

11、選擇代表性的組合進(jìn)行驗(yàn)證，并使用最差條件進(jìn)行模擬。待清潔成分設(shè)備分組設(shè)備分組u設(shè)備分組驗(yàn)證策略 當(dāng)設(shè)備相同時，可以設(shè)計(jì)一個檢測矩陣，每次檢測時抽取幾個設(shè)備，合計(jì)完成本次全部項(xiàng)目的檢測，共驗(yàn)證至少3次，驗(yàn)證結(jié)束后每臺設(shè)備至少有1個項(xiàng)目被檢測1次。只要給出充分的理由說明設(shè)備的項(xiàng)目是“相同”的，就沒有必要對該組中每個設(shè)備的每個項(xiàng)目都驗(yàn)證一次。為了便于管理，也可以抽取其中3臺設(shè)備，分別進(jìn)行一次完整的檢測，其他設(shè)備各抽檢一次，只抽檢個別項(xiàng)目。 對于“相似”的設(shè)備，要選取最差情況的設(shè)備為代表，或者對設(shè)備進(jìn)行歸類。例如，在容積相同但構(gòu)造不同的儲液罐中，選擇構(gòu)造更復(fù)雜的設(shè)備作為最差情況。在構(gòu)造相似但容積不同的

12、儲液罐中，選擇最大和最小的（代表極端情形）來進(jìn)行正式的驗(yàn)證運(yùn)行（除非某個容積可以認(rèn)定為最差情況）。對該組中的其它設(shè)備（不是最差情形）選擇確認(rèn)運(yùn)行（至少一個批次）。待清潔成分待清潔成分待清潔成分u 在清潔驗(yàn)證中，為所有待清潔成分都制定限度標(biāo)準(zhǔn)并一一檢測是不切實(shí)且沒有必要的。在一定的意義上，清潔的過程是個溶解的過程，因此，通常的做法是從各組分中確定最難清潔（溶解）的物質(zhì)，以此作為參照物質(zhì)，或者根據(jù)待清潔成分的共有特性，選擇一個指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。u 待清潔成分可分為活性成分、工藝相關(guān)雜質(zhì)、輔料、清潔劑、微生物（來自物料、清潔過程、環(huán)境）?；钚猿煞挚赡馨a(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如聚合體，降解物等。不同生產(chǎn)階段可能

13、含有不同的工藝相關(guān)雜質(zhì)。比如發(fā)酵階段含工程菌及細(xì)胞碎片等，在純化階段含細(xì)菌內(nèi)毒素、菌體蛋白、外源DNA等。清潔劑最常用的是氫氧化鈉溶液，可能還有酸、表面活性劑等。u 示例示例待清潔成分待清潔成分待清潔成分待清潔成分u 最難參照物的選擇u 單組分產(chǎn)品：組份=參照物原料藥直接分裝u多種成份一般原則最難參照物選擇考慮因素清潔能力藥物活性成分和輔料的水溶性殘留影響導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)功能分類毒性u如最難清潔物質(zhì)非單一物質(zhì)，則將一起作為最難清潔物質(zhì)?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿 清潔驗(yàn)證方案中最關(guān)鍵的技術(shù)問題為如何確定可接受限度。選擇產(chǎn)物殘留、清潔劑、微生物污染，以及其他任何工藝成分的限度，邏輯上應(yīng)該基于物料對生產(chǎn)流程

14、和產(chǎn)品的安全性和純度的影響而定。可接受限度通常由企業(yè)自己確定。確定的可接受限度應(yīng)該具有“實(shí)用性、易獲取性、可驗(yàn)證性”。u 對于不同的生產(chǎn)階段，可接受限度可以有所區(qū)別，比如前期階段，如發(fā)酵、純化，由于后面還有純化步驟，因此其清潔標(biāo)準(zhǔn)可適當(dāng)放寬。u 計(jì)算設(shè)備內(nèi)表面積不能只考慮單個設(shè)備，而應(yīng)考慮產(chǎn)品生產(chǎn)過程中所接觸的整個設(shè)備鏈的面積，過高估計(jì)設(shè)備表面積是保險(xiǎn)的做法。可接受限度可接受限度 活性物質(zhì)限度 清潔劑限度 微生物限度 內(nèi)毒素限度 視覺清潔標(biāo)準(zhǔn)可接受限度可接受限度u活性物質(zhì)限度： 10ppm：上批產(chǎn)品殘留在設(shè)備里的物質(zhì)全部溶解到下批產(chǎn)品中的濃度限度不超過10ppm（百萬分之十）。1ppm=1mg

15、/kg=1mg/L=110-6 1/1000 MinTD：上批產(chǎn)品殘留在下批產(chǎn)品的活性成分不得高于最低日治療劑量的千分之一?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿活性物質(zhì)限度 純化層析工藝具有選擇性，殘留的活性蛋白難以在工藝步驟中逐步向下傳遞。在清潔劑的作用下，殘留的活性蛋白也容易被分解。 因此用于制劑生產(chǎn)階段的MAC計(jì)算通常不適用于原液的生產(chǎn)。 參考PDA TR49指南中的規(guī)定，可以選擇使用一些限制區(qū)域的表面積計(jì)算殘留量，例如使用最后一步純化工藝后的所有生產(chǎn)設(shè)備。 根據(jù)相關(guān)清潔驗(yàn)證指南的推薦，原液生產(chǎn)階段，可接受標(biāo)準(zhǔn)通常為下游工藝TOC 1-2ppm和上游工藝TOC 5-10ppm。對于如超濾膜和色譜填料這

16、些產(chǎn)品專用材料可以更高?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿MACMAC計(jì)算公式計(jì)算公式MAC：Maximum Allowable Carryover，最大允許殘留量。MinTD：已清潔的產(chǎn)品的活性物質(zhì)的最小日治療劑量。MBS：使用同一設(shè)備生產(chǎn)的下一產(chǎn)品的活性物質(zhì)的最小批量。MaxDD：使用同一設(shè)備生產(chǎn)的下一產(chǎn)品的活性物質(zhì)的最大日劑量。SF：安全因子。SF=1000。MinTDMBSMAC=SFMaxDD可接受限度可接受限度uTOC與蛋白值的關(guān)系通常清潔驗(yàn)證采用TOC作為分析方法，TOC的定量限度大約為100500ppb碳，與含碳量為50%的約2001000ppb蛋白質(zhì)的數(shù)值等效（基于生物制品）可接受限度可

17、接受限度u清潔劑限度：我司的清潔劑成分包括：NaOH、NaCl和水。其中NaCl和水是人體的正常成分，毒性可以忽略。通常的做法是用電導(dǎo)率的值為其設(shè)定間接的限度。氫氧化鈉的可接受水平建立在毒理學(xué)的殘留量計(jì)算或者是工藝參數(shù)的效果之上。因此，限度是基于注射用水的標(biāo)準(zhǔn)或者是稍高于這個標(biāo)準(zhǔn)（例如5 S/cm）?；谑惺刍瘜W(xué)試劑的毒性計(jì)算是比較極端的，因?yàn)闅溲趸c并不會以氫氧化鈉的形式污染到最終的產(chǎn)品中。如果這些化學(xué)物質(zhì)以高濃度完整地污染下來，通過工藝檢查（這樣會引起PH的顯著變化）也會發(fā)現(xiàn)這種不符合性。因此，目標(biāo)并不要求與注射用水的標(biāo)準(zhǔn)一致，而是確認(rèn)一個很低的清潔劑含量。而允許電導(dǎo)率限度略高于注射用水限

18、度的原因是，注射用水的限度要求只是適用于管路中的循環(huán)注射用水。一旦從循環(huán)管路中取出來并通過清潔設(shè)備（尤其是通過噴淋裝置時它可以從空氣中攝取二氧化塔），不要期望它一定會滿足WFI的電導(dǎo)率限度?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿 清潔劑限度： 閱毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫（http:，美國），NaOH的LD50為40 mg/kg（mouse，ip.），具有較高的安全閾值。假設(shè)NaOH對于人的LD50和小鼠一致，按照成人體重為60kg計(jì)，則需要注射2.4g NaOH才能達(dá)到半致死劑量。 檢測清潔劑殘留常用方法為電導(dǎo)率和pH。根據(jù)測試結(jié)果，25s/cm（25）時的NaOH濃度約為5.5g/m

19、l。計(jì)算可得，pH為8（25）時，NaOH濃度為10-6mol/L（折合為0.04g/ml）。在電導(dǎo)率為25s/cm（25）或pH為8時，每支制劑產(chǎn)品中的NaOH殘留量最大為9.35g（rhG-CSF 480g/支的裝量為1.7ml/支），遠(yuǎn)低于半致死劑量的千分之一?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿微生物限度u不要預(yù)期清潔過程會導(dǎo)致設(shè)備的無菌結(jié)果。u即使設(shè)備將進(jìn)行在線滅菌或者是在下一產(chǎn)品生產(chǎn)前滅菌，通常的做法是評估微生物負(fù)載來確保隨后的生產(chǎn)工藝不會被過度挑戰(zhàn)。u只要達(dá)到一般的非無菌生產(chǎn)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（1-2CFU/cm2表面取樣方法）就已經(jīng)是足夠的。u對于沖洗取樣，一些公司將利用典型WFI的值（10 C

20、FU/100毫升），而其他公司將利用100 CFU/100毫升或1,000 CFU/100毫升的值。設(shè)定較高的限度原因是隨后設(shè)備將進(jìn)行滅菌。u制定方法u下批產(chǎn)品原料及生產(chǎn)過程既不增加微生物繁殖，也不會減少微生物繁殖u下批產(chǎn)品生產(chǎn)前設(shè)備在生產(chǎn)前不滅菌，但產(chǎn)品最終滅菌u下批產(chǎn)品生產(chǎn)前設(shè)備在生產(chǎn)前需要滅菌可接受限度可接受限度u微生物限度下批產(chǎn)品生產(chǎn)前設(shè)備在生產(chǎn)前不滅菌，但產(chǎn)品最終滅菌，其微生物限度設(shè)定方法以滅菌前微生物含量限度為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算產(chǎn)品的無菌保證值的大小與滅菌前工藝的F0值以及滅菌前微生物的含量有關(guān)，因此任何一個經(jīng)過驗(yàn)證的滅菌工藝都需要確定允許的滅菌前微生物的限度，知曉這個限度后，后面的計(jì)算

21、與第一種情況就一致?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿內(nèi)毒素限度u在內(nèi)毒素經(jīng)各個去除步驟后，內(nèi)毒素對最終產(chǎn)品的殘留量是更值得關(guān)注的。u內(nèi)毒素通常只在最后的沖洗水測定，限度設(shè)定通常是注射用水標(biāo)準(zhǔn)0.25EU/ml。u對于用大腸桿菌進(jìn)行的細(xì)菌發(fā)酵（革蘭氏陰性細(xì)菌，在沖洗過程中能夠生產(chǎn)大量的內(nèi)毒素），在發(fā)酵和收獲步驟后的清洗符合注射用水限度，是不可能完成的，這種情形下，其它公司在更高的水平設(shè)置內(nèi)毒素限度，例如5-25 EU/ml?？山邮芟薅瓤山邮芟薅萿視覺清潔標(biāo)準(zhǔn)：不得有可見殘留物。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，目檢能發(fā)現(xiàn)最低的殘留物限度是1g/ cm2。視覺檢驗(yàn)是核實(shí)殘留物去除的一種直接衡量手段，很容易完成。做到每個樣品都檢

22、。 設(shè)備表面無可見殘留物檢查要包括兩個部分 終洗水或淋洗水無可見殘留物取樣方法取樣方法u取樣方法應(yīng)根據(jù)設(shè)備的類型、被取樣點(diǎn)的材料、設(shè)備的構(gòu)型等綜合考慮。必要時可采用幾種不同的取樣方法，使樣品具有更好的代表性。取樣方法應(yīng)是實(shí)用的，易培訓(xùn)的，否則清潔的狀態(tài)難以監(jiān)控。u取樣方法:u直接取樣法（目檢）、u沖洗取樣、u擦拭取樣、u空白模擬取樣。GM取樣方法取樣方法u擦拭取樣具有機(jī)械力，可以取到難溶性的殘留，可以分析特殊的區(qū)域、難清潔的區(qū)域，但有些區(qū)域無法進(jìn)行取樣。應(yīng)詳細(xì)規(guī)定擦拭溶劑和藥簽，藥簽的濕潤程度，擦拭的力度、角度、路線、擦拭面積等。u最終沖洗水取樣要求待測殘留物具有良好的溶解性，適用于大面積，無

23、法直接取樣或不能拆卸的設(shè)備。取樣應(yīng)規(guī)定沖洗方式和沖洗量，確保殘留物能夠溶解到?jīng)_洗水中，并且要避免大量沖洗水稀釋殘留污染物。此外，小的部件還可以拆卸后浸入浸提液取樣。GMu擦拭取樣TOC擦拭采樣 取樣前首先目測，確保無可見殘留物。 選定所要擦拭的表面積。將擦拭子潤濕，然后按在取樣表面上，用力將其稍微彎曲，使棉簽整個平面接觸擦拭表面，平穩(wěn)而緩慢的擦拭取樣表面，具體擦拭方法見下圖。取樣方法取樣方法 每個取樣部位每次采樣用1根TOC專用棉簽擦拭。擦拭完成后，將TOC專用藥簽折斷，放入40ml TOC專用瓶內(nèi)，把蓋子密封好，進(jìn)行編號。u最終沖洗水取樣測外觀、電導(dǎo)、pH取樣要求用透明潔凈的玻璃瓶取樣150

24、ml（每項(xiàng)50ml），取樣前玻璃瓶用注射用水蕩洗3遍。測TOC水樣取樣要求用TOC專用取樣瓶裝滿樣品，取樣瓶在取樣前先用注射用水蕩洗3遍。檢微生物取樣要求用無菌50ml離心管取樣50ml，取樣后離心管應(yīng)用封口膜密封。測細(xì)菌內(nèi)毒素取樣要求用無菌無熱源注射器或離心管取樣5ml，取樣后離心管應(yīng)用封口膜密封蛋白殘留量潔凈1.5ml EP管取1ml，取樣后EP管應(yīng)用封口膜密封。取樣方法取樣方法u最終沖洗水取樣層析柱終洗水取樣要求檢外觀、電導(dǎo)、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物、蛋白殘留量項(xiàng)目的取樣要求同上。應(yīng)注意層析柱流出管道應(yīng)垂直懸空，必要時，取樣前管道先用消毒酒精擦拭，排掉部分流出液后取中段樣。層析柱空白樣取

25、樣要求檢外觀項(xiàng)目用透明潔凈玻璃瓶取50ml；檢蛋白殘留量/宿主菌蛋白質(zhì)/外源性DNA殘留量用無菌無熱源離心管取5ml；檢內(nèi)毒素用無菌無熱源離心管取5ml；微生物項(xiàng)目用無菌離心管取50ml ，取樣后離心管用封口膜密封。取樣方法取樣方法u空白模擬取樣在生物制藥中，空白模擬取樣一般僅包括注射用水或不含產(chǎn)品的工藝緩沖溶液。在此取樣過程中，設(shè)備是清潔的。清潔后，只使用注射用水或緩沖液運(yùn)行生產(chǎn)流程（盡最大可能）。運(yùn)行后，像任何其它清潔驗(yàn)證的樣品一樣，對注射用水或緩沖液進(jìn)行評價(jià)，項(xiàng)目通常包括TOC(或總蛋白)、電導(dǎo)率、生物負(fù)載和內(nèi)毒素，分析所制造產(chǎn)品的殘留物是否成為任何可能的污物。在原液和制劑生產(chǎn)中都可以進(jìn)

26、行空白模擬運(yùn)行，以論證工藝材料的實(shí)際污染量。取樣方法取樣方法取樣點(diǎn)的選擇取樣點(diǎn)的選擇u選取取樣點(diǎn)應(yīng)考慮設(shè)備最難清洗部位、關(guān)鍵部位、最有代表性部位、結(jié)構(gòu)材料的不同部位、取樣點(diǎn)的方便性和重現(xiàn)性、設(shè)備的總尺寸。u對于擦拭取樣，通常不可能擦拭設(shè)備的全部表面，因此，應(yīng)該選擇設(shè)備的最差區(qū)域作為取樣點(diǎn)。這些區(qū)域應(yīng)在清潔難度和殘留水平方面代表著對清潔規(guī)程最大程度的挑戰(zhàn)，例如：人孔、料斗的底部、槳拌槳葉底部和閥門的周圍。u如果進(jìn)行微生物取樣，取樣計(jì)劃應(yīng)包括微生物的可能最差區(qū)域，例如：較難靠近的地方以及可收集水的排水區(qū)域。微生物和化學(xué)取樣應(yīng)在不同區(qū)域進(jìn)行，測試方案中應(yīng)包括設(shè)備及其取樣點(diǎn)的描述或圖表。u對于最終沖洗水取樣，取樣時要從設(shè)備專用取樣口或者產(chǎn)品出料口取樣。檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法u特異性：活性成分色譜分析：HPLC,GC,高效薄層色譜（HPTLC）是非常靈敏和有效的。ELISA：對于生物藥非常有效，但是昂貴、費(fèi)力。電泳：靈敏度較低u非特異性UV光譜：有適度的特異性，不需要定量檢測。TOC:針對通用污染物或總蛋白?？傆袡C(jī)碳分析儀是非常靈敏的，但不是特定的。應(yīng)該和pH與電導(dǎo)率一起使用。pH：請氫離子非常敏感。用于清潔程序中的酸和堿的追蹤。電導(dǎo)率：對所有離子敏感。（當(dāng)TOC、pH和電導(dǎo)率聯(lián)合使用時，在清潔驗(yàn)證分析方法中被證明是非常有效的。）內(nèi)毒素及微生物特殊設(shè)備的清潔驗(yàn)證特殊設(shè)備的清潔驗(yàn)證u特殊設(shè)備的