CRISPRCas9基因組編輯技術(shù)、

1、CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)與基因組編輯技術(shù)與植物基因功能研究植物基因功能研究尹翠翠、田正書、李德富、高虎虎尹翠翠、田正書、李德富、高虎虎CRISPR/Cas9clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)核酸酶9系統(tǒng)1987 年，Ishino 等研究大腸桿菌 iap 基因的序列和功能時發(fā)現(xiàn)，在該基因的 3 端非翻譯區(qū)存在 5 個 高度保守的長為 29 nt 的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列被長度為 32 nt 的非重復(fù)序列間隔開2007 年，Barrango

2、u 等3首次利用實(shí)驗(yàn)證明了嗜熱鏈球菌的 CRISPR 系統(tǒng)直接參與細(xì)菌對噬菌體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)2012 年，Jinek 等對細(xì)菌的 II 型 CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行改造和優(yōu)化，成功地在體外定點(diǎn)切割了環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 和線性寡聚核苷酸片段CISP-Cas 系統(tǒng)與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)有關(guān)細(xì)菌和古細(xì)菌破壞噬菌體和外源質(zhì)粒的免疫保護(hù)CISP-Cas 系統(tǒng)可識別并降解外源入侵的 DNA 序列CRISPR/Cas9CISP 基因簇由 CISP 序列與 Cas 蛋白的編碼基因組成CISP 序列為一系列由不同的間隔序列( spacers) 間隔的同向重復(fù)序列間隔序列來源于外源基因片段即原間隔序列

3、Cas 蛋白的編碼基因?qū)⒈磉_(dá)為核酸酶、解旋酶與聚合酶等；CISP 序列則轉(zhuǎn)錄加工為短的 CISP NAs( crNAs) ，指導(dǎo) Cas 蛋白與外源入侵片段的識別與降 解。CISP-Cas 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的基本原理，通常將 crNA 與 tracrNA 序列融合為一條引導(dǎo) NA 序列( single gNA，sgNA)CISP-Cas9基因組編輯技術(shù)NA介導(dǎo)的靶向內(nèi)切酶 CISP-Cas9 基因組編輯技術(shù)通過一段短的引導(dǎo) NA( guideNA) 來引導(dǎo)CAS 9蛋白識別特定的 DNA 序列基因組編輯技術(shù)4 種用于基因組編輯的的人工核酸內(nèi)切酶種用于基因組編輯的的人工核酸內(nèi)切酶巨核酶技

4、術(shù)( Meganucleases鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)(Urnov等2010)轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)基因組基因組編輯技術(shù)編輯技術(shù)成本較高，操作較為繁瑣，脫靶風(fēng)險較高。規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)核酸酶9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CAS9) (Mali等2013)ADVANTAGE利用多個引導(dǎo) NA 序

5、列可同時進(jìn)行基因組上多個不同位點(diǎn)的編輯; 將其DNA 結(jié)合域與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白相融合，可實(shí)現(xiàn)對特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制; 將對特定序列的調(diào)控蛋白模塊與基因組或表觀基因組的修飾酶相融合，則可實(shí)現(xiàn)對基因組的動態(tài)控制Application of CRISPR/CasTechnology引導(dǎo) gNA 的選擇靶 DNA 序列的設(shè)計Cas9 與 gNA 的表達(dá)與定位提高打靶特異性的策略降低 sgNA 與Cas9 的濃度，但這一方法的效果還有待討論。有研究表明該方法可顯著降低脫靶突變/打靶突變的比例，但也有研究稱該方法將同時降低脫靶突變與打靶突變的發(fā)生。利用 Cas9 的切口酶突變體( D10A 突變體或 H840A 突變體) 產(chǎn)生 DNA 單鏈斷裂。sgNA 的截短與修飾，如截短其 3端相當(dāng)于 tracrNA 的序列、在其 5端增加兩個額外的 GG 以及在截短互補(bǔ)識別序列中 5端的2 個或 3 個堿基均可提高 Cas9 的特異性。目前，C