蛋白質化學一級結構及分析

1、 氨基酸的多聚物氨基酸的多聚物，分子量，分子量大小差異極大大小差異極大，可以是，可以是2或或3個到成千上萬個氨基酸殘基連接而成。個到成千上萬個氨基酸殘基連接而成。 兩個氨基酸殘基之間通過共價的兩個氨基酸殘基之間通過共價的酰胺鍵（肽鍵）酰胺鍵（肽鍵）連連接形成一個接形成一個二肽二肽；三個氨基酸殘基連接成；三個氨基酸殘基連接成三肽三肽；有限數(shù)量的數(shù)十個氨基酸殘基連接成有限數(shù)量的數(shù)十個氨基酸殘基連接成寡肽寡肽；多個氨；多個氨基酸殘基則連接成基酸殘基則連接成多肽多肽；蛋白質蛋白質可以是成千上萬個可以是成千上萬個氨基酸殘基連接而成。氨基酸殘基連接而成。 多肽與蛋白質有時混用，但一般將分子量在多肽與蛋白質

2、有時混用，但一般將分子量在10000以下以下的稱為的稱為多肽多肽。 肽或蛋白質的肽或蛋白質的水解是耗能的水解是耗能的，由于高的活化能，水，由于高的活化能，水解很慢，蛋白質的解很慢，蛋白質的肽鍵非常穩(wěn)定肽鍵非常穩(wěn)定，多數(shù)胞內條件下，多數(shù)胞內條件下的半衰期為的半衰期為7年。年。肽鍵肽鍵就是一個就是一個氨基酸的氨基酸的-羧基羧基與與另另一個氨基酸的一個氨基酸的-氨基氨基脫水縮合脫水縮合形成形成的鍵的鍵 縮合水解氨基酸連接成肽鏈后，由于氨基酸之間通過一個氨基酸連接成肽鏈后，由于氨基酸之間通過一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基縮合脫水，肽鏈上氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基縮合脫水，肽鏈上的一個的一個

3、氨基酸單位氨基酸單位被稱為被稱為殘基殘基（residue），帶有游離），帶有游離 -氨基的一端被稱為氨基的一端被稱為氨基（末）端（或氨基（末）端（或N端）端），帶有游帶有游離離 -羧基的一端被稱為羧基的一端被稱為羧基（末）端（或羧基（末）端（或C端）端）。H2N-S-G-Y-A-L-COOH 氨基酸形成肽鏈后，整個肽鏈上留下氨基酸形成肽鏈后，整個肽鏈上留下N端端可解離的可解離的氨基氨基、羧基端羧基端可解離的可解離的羧基羧基、側鏈側鏈上能夠解離的上能夠解離的R基團基團，中間氨基酸的，中間氨基酸的 -氨基和氨基和 -羧基由于形成肽鍵而不再對整個肽鏈羧基由于形成肽鍵而不再對整個肽鏈的解離有貢獻。的解

4、離有貢獻。 肽也有肽也有特征滴定曲線特征滴定曲線及及特征特征pI。 R基團的解離常數(shù)基團的解離常數(shù)由于氨基酸的氨基和羧基被用于形成肽鍵成為了由于氨基酸的氨基和羧基被用于形成肽鍵成為了殘基殘基，其解離在，其解離在一一定程度上會發(fā)生改變定程度上會發(fā)生改變，這種變化受到，這種變化受到 -氨基及氨基及 -羧基失去電荷、與其他羧基失去電荷、與其他R基團的作用、基團的作用、其他能夠影響解離常數(shù)的環(huán)境因子有關。其他能夠影響解離常數(shù)的環(huán)境因子有關。不能對生物活性肽及蛋白質的不能對生物活性肽及蛋白質的分子量分子量與功能之間與功能之間作出相關性結論作出相關性結論。自然存在。自然存在的肽的大小從的肽的大小從2個到數(shù)

5、千個氨基酸殘基，個到數(shù)千個氨基酸殘基，甚至甚至最小的肽也能表現(xiàn)出重要的生物學最小的肽也能表現(xiàn)出重要的生物學作用作用，如商業(yè)化合成的二肽，如商業(yè)化合成的二肽L-天冬氨酰天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯苯丙氨酸甲酯人工甜味劑人工甜味劑-阿斯巴甜阿斯巴甜(aspartame)或紐特健康糖或紐特健康糖（NutraSweet)，比蔗糖甜，比蔗糖甜200倍倍。1965年由科學家年由科學家JamesSchlatter在研究蛋白質時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)在研究蛋白質時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)16年年100多次的科學研究多次的科學研究及驗證后，阿斯巴甜于及驗證后，阿斯巴甜于1981年年(FDA批準）以批準）以Nutrasweet（紐特健康糖）品牌

6、正式（紐特健康糖）品牌正式推出市面。推出市面。1986年我國衛(wèi)生部批準可用于除罐頭以外的所有食品中。年我國衛(wèi)生部批準可用于除罐頭以外的所有食品中。COCH2CH2CHNH2COOHNHCHCH2SHCONHCH2COOHgamma-Glu-L-Cys-AlaGSH可被氧化成可被氧化成GSSGGSH作用：在紅細胞中作為巰基緩沖劑存在；作用：在紅細胞中作為巰基緩沖劑存在；維持血紅蛋白和其它紅細胞蛋白質的半胱氨酸殘基維持血紅蛋白和其它紅細胞蛋白質的半胱氨酸殘基處于還原狀態(tài)。處于還原狀態(tài)。例如，它可防止例如，它可防止H2O2將紅細胞中血色素的二價鐵氧化成將紅細胞中血色素的二價鐵氧化成三價鐵形成高鐵血紅

7、蛋白。三價鐵形成高鐵血紅蛋白。谷胱甘肽谷胱甘肽Glutathion(e)（GSH）(GSSG)H2N-Glu-Cys-Gly-COOH肌聯(lián)蛋白 一些脊椎動物的一些脊椎動物的激素激素是小肽，包括是小肽，包括催產素催產素（oxytocin）（）（9個氨基酸殘基），由垂體個氨基酸殘基），由垂體后葉制造后葉制造，能，能刺激子宮收縮刺激子宮收縮；舒緩激肽舒緩激肽（bradykinin）（）（9肽）能使呼吸道肽）能使呼吸道平滑肌收平滑肌收縮，抑制組織炎癥縮，抑制組織炎癥；甲狀腺激素釋放因子甲狀腺激素釋放因子（3肽），下丘腦分泌，能刺激垂體前葉肽），下丘腦分泌，能刺激垂體前葉促促甲狀腺素的釋放甲狀腺素的釋放

8、，它們，它們發(fā)揮作用的濃度極低發(fā)揮作用的濃度極低。 與許多與許多抗生素抗生素一樣，一些極毒的一樣，一些極毒的毒蘑菇毒素毒蘑菇毒素，如，如鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿（毒素）（毒素）(雙環(huán)的雙環(huán)的8肽毒素）肽毒素）(amanitin)，對動物有致死作用，與真核生物，對動物有致死作用，與真核生物RNAII聚合酶作用抑制轉錄。聚合酶作用抑制轉錄。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽腦啡肽Leu-腦啡肽腦啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催產素CysTyrGlnAsnCysProSSP

9、heArgGlyNH2牛加壓素牛催產素牛催產素牛加壓素牛加壓素NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鵝膏覃堿的化學結構鵝膏蕈堿（鵝膏毒素、蠅蕈素）的化學結構鵝膏蕈堿（鵝膏毒素、蠅蕈素）的化學結構 一些蛋白質只含有一些蛋白質只含有一條簡單的多肽鏈一條簡單的多肽鏈，而另一些蛋，而另一些蛋白質成為白質成為多亞基蛋白質多亞基蛋白質，含有兩條或更多條，含有兩條或更多條非共價非共價結合結合的多肽鏈。多亞基蛋白質的獨立的多肽鏈可以的多肽鏈。多亞基蛋白質的獨立的多肽鏈可

10、以是同一多肽鏈，也可以是不同的多肽鏈。是同一多肽鏈，也可以是不同的多肽鏈。 有時，不同的亞基形成有時，不同的亞基形成小的小的寡聚體寡聚體(oligomeric)，并以此進一步裝配。這種小的寡聚體被稱為并以此進一步裝配。這種小的寡聚體被稱為原體原體(protomers)，原體再裝配成更大的聚集體。如，原體再裝配成更大的聚集體。如血血紅蛋白紅蛋白，四條非共價結合的多肽鏈，兩條一致的，四條非共價結合的多肽鏈，兩條一致的 鏈和兩條相同的鏈和兩條相同的 鏈，可以稱為鏈，可以稱為四條多肽亞基的四四條多肽亞基的四聚體聚體或者或者原體的二聚體原體的二聚體；天冬氨酸氨甲酰磷酸轉天冬氨酸氨甲酰磷酸轉移酶移酶由由6

11、個調節(jié)亞基（個調節(jié)亞基（R）和）和6個催化亞基（個催化亞基（C）組）組成，裝配時先由成，裝配時先由1個個C亞基和亞基和1個個R亞基組成一個原亞基組成一個原體體CR，再由，再由6個原體裝配成一個有活性的酶。個原體裝配成一個有活性的酶。胰島素的兩條多肽鏈通過胰島素的兩條多肽鏈通過二硫鍵二硫鍵共價連接共價連接，這種情況下，單條多肽鏈，這種情況下，單條多肽鏈不是亞基，通常被簡單地認為是肽鏈。不是亞基，通常被簡單地認為是肽鏈。因此因此一條多肽鏈及共價連接的多肽鏈一條多肽鏈及共價連接的多肽鏈不是四級結構不是四級結構。 可以從一個不含有其他化學基團的蛋白質分子估算其中的氨基酸殘基的大概數(shù)目，用可以從一個不含

12、有其他化學基團的蛋白質分子估算其中的氨基酸殘基的大概數(shù)目，用蛋白質的分子量除以蛋白質的分子量除以110，即為組成氨基酸的數(shù)目。，即為組成氨基酸的數(shù)目。 20種氨基酸的平均分子量為種氨基酸的平均分子量為138，較小的氨基酸在多數(shù)蛋白質中的豐度高，如果考慮，較小的氨基酸在多數(shù)蛋白質中的豐度高，如果考慮不同氨基酸在蛋白質中出現(xiàn)的比例，平均分子量只有不同氨基酸在蛋白質中出現(xiàn)的比例，平均分子量只有128，形成肽鍵時，形成肽鍵時失去一分子水失去一分子水（18），因此，蛋白質分子中），因此，蛋白質分子中氨基酸殘基的平均分子量氨基酸殘基的平均分子量為為128-18=110。多肽具有多肽具有特征性的氨基酸特征性

13、的氨基酸組成組成，多肽或蛋白質以酸，多肽或蛋白質以酸水解產生游離水解產生游離 -氨基酸的氨基酸的混合物。當完全水解時，混合物。當完全水解時，每一種類型的蛋白質產生每一種類型的蛋白質產生一種一種特征性的氨基酸比例特征性的氨基酸比例或混合物或混合物。20種氨基酸種氨基酸幾乎從不以相同的比例出幾乎從不以相同的比例出現(xiàn)在一個蛋白質中現(xiàn)在一個蛋白質中，有高，有高有低，甚至有的只出現(xiàn)一有低，甚至有的只出現(xiàn)一次或根本不出現(xiàn)。次或根本不出現(xiàn)。很多蛋白質，如很多蛋白質，如核糖核苷酸酶核糖核苷酸酶、胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶，僅含有氨基酸殘基，沒有其他，僅含有氨基酸殘基，沒有其他化學基團化學基團-單純蛋白質單純蛋白

14、質。但有些蛋白質，除氨基酸殘基外，還含有。但有些蛋白質，除氨基酸殘基外，還含有永久連接永久連接的化學組成，的化學組成，被稱為被稱為復合蛋白質復合蛋白質，非氨基酸連接的化學基團被稱為，非氨基酸連接的化學基團被稱為輔基輔基(prostheticgroup)。復合蛋。復合蛋白質的分類根據(jù)輔基的化學特性，如白質的分類根據(jù)輔基的化學特性，如脂蛋白脂蛋白含有含有脂脂、糖蛋白糖蛋白含有含有糖糖、金屬蛋白金屬蛋白含有特異含有特異的的金屬金屬。有些蛋白質甚至含有。有些蛋白質甚至含有不止一種輔基不止一種輔基，輔基通常，輔基通常對蛋白質的功能起重要作用。對蛋白質的功能起重要作用。鐵蛋白酪蛋白質體藍素肽末端肽末端-羧

15、基羧基pKa值比游離值比游離AA中的大中的大，而肽末端而肽末端-氨基氨基pKa值比游離值比游離AA中的中的小小，側鏈，側鏈R基的差別不大基的差別不大。等電點（兩性）。等電點（兩性）。酸堿性質取決于：酸堿性質取決于：-羧基、羧基、-氨基、側鏈基團的解離氨基、側鏈基團的解離具有具有雙縮脲雙縮脲(biuret)反應反應(H2N-CO-NH-CO-NH2)-Pr特有的反應特有的反應（與硫酸銅（與硫酸銅-氫氧化鈉溶液產生氫氧化鈉溶液產生紫紅色紫紅色或或藍紫色藍紫色顏色顏色反應，可用于肽和蛋白質定量測定）。反應，可用于肽和蛋白質定量測定）。 1952年丹麥人年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出

16、蛋白質的結構可以分成四個層次最早提出蛋白質的結構可以分成四個層次:一級結構一級結構：二二級結構：級結構：三三級結構：級結構：四四級結構：級結構： 1969年正式將年正式將一級結構一級結構定義為定義為氨基酸序列和二硫氨基酸序列和二硫鍵的位置鍵的位置。介于二級結構和三級結構之間還存在介于二級結構和三級結構之間還存在超二級結構超二級結構（二級結構的組合）和（二級結構的組合）和結構域結構域（在空間上相對獨立（在空間上相對獨立的三維結構的實體）這兩個層次。的三維結構的實體）這兩個層次。肽鍵將氨基酸與氨基酸肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾頭尾相連相連CONCN+O-CNCOHC 肽鍵的特點是肽鍵的特點是氮原子上的

17、孤對電子與羰基具有明氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用顯的共軛作用。 組成組成肽鍵的原子處于同一平面肽鍵的原子處于同一平面。 肽鍵中的肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質鍵具有部分雙鍵性質，不能自由旋，不能自由旋轉。轉。 在大多數(shù)情況下，以在大多數(shù)情況下，以反式結構存在反式結構存在。肽鍵平面肽鍵平面兩個兩個肽鍵平面之間的肽鍵平面之間的-碳原碳原子子，可以作為一個，可以作為一個旋轉點旋轉點形成形成二面角二面角(dihedralangle)。二面角的變化，決。二面角的變化，決定著多肽主鍵在三維空間定著多肽主鍵在三維空間的排布方式，是形成不同的排布方式，是形成不同蛋白質構象的基礎。蛋白質構象的基

18、礎。繞繞C-N鍵軸旋轉的二面角鍵軸旋轉的二面角（C-N-C-C）稱為）稱為，繞，繞C-C鍵軸旋轉鍵軸旋轉的二面角的二面角（N-C-C-N）稱為）稱為，原原則上則上和和可以取可以取-180+180之之間的任一值間的任一值，這樣多肽鏈主鏈的各，這樣多肽鏈主鏈的各種可能構象都可用種可能構象都可用和和這兩個二面這兩個二面角或扭角來描述。角或扭角來描述。研究蛋白質的研究蛋白質的，就是要將，就是要將氨基酸的排列順序氨基酸的排列順序搞清楚。搞清楚。二十世紀四十年代起，許多人不遺二十世紀四十年代起，許多人不遺余力地從事蛋白質的一級結構研究，余力地從事蛋白質的一級結構研究，第一個將一個蛋白質（第一個將一個蛋白質

19、（）的所有氨基酸的排列順序通過）的所有氨基酸的排列順序通過高度的實驗技巧加以確定。高度的實驗技巧加以確定。 最小的蛋白質，由最小的蛋白質，由A鏈鏈(21AA)和和B鏈鏈(30AA)組成；組成；胰腺胰腺細胞細胞分泌的一種激素，分泌的一種激素，告訴細胞往里面運輸糖、氨基酸、告訴細胞往里面運輸糖、氨基酸、K+； 1921年年Banting&Best從胰腺中抽提從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，出了有活性的胰島素，1923年年Banting&Macleod獲獲Nobel醫(yī)學獎；醫(yī)學獎； 194353年，年，Sanger確定了牛胰島素確定了牛胰島素的一級結構，的一級結構，1958年獲得年獲得Nobel化學

20、獎；化學獎； 1981年，年，Berg（因（因DNA重組技術得獎）重組技術得獎）在大腸桿菌中表達了人胰島素。在大腸桿菌中表達了人胰島素。 Frederick Sanger (1918- ) is a British molecular biologist who was working on problems related to the determination of the structure of proteins. His studies resulted in the determination of the structure of insulin in 1953; for th

21、is discovery he received Nobel Prize in Chemistry in 1958. In 1965, he developed the chain termination method, also known as the Sanger method. He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids. In 1992, the S

22、anger Centre in Cambridge, named after Frederick Sanger, was founded by the Wellcome Trust and the British Medical Research Council, the purpose of which is stated on their website as “to provide a major focus in the UK for mapping and sequencing the human genome, and genomes of other organisms. 兩獲諾

23、貝爾獎兩獲諾貝爾獎（僅（僅4人），人），唯一兩獲諾貝唯一兩獲諾貝爾化學獎。爾化學獎。Sanger試劑試劑(FDNB)標記標記N末末端端ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 結論結論：A B C D E氨基酸自動分析儀氨基酸自動分析儀Edman降解法降解法Sanger法法1958年設計獲獲19721972年諾貝爾化學獎年諾貝爾化學獎氨基酸分析儀是進行氨基酸分析儀是進行氨基酸分離氨基酸分離、衍生衍生和和檢測檢測的自動化分析系統(tǒng)，廣的自動化分析系統(tǒng)，廣泛用于制藥、食品、飼料、農業(yè)、

24、泛用于制藥、食品、飼料、農業(yè)、育種、醫(yī)學研究、臨床診斷和地質育種、醫(yī)學研究、臨床診斷和地質考察等領域?？疾斓阮I域。 原理：陽離子交換分離、柱后茚三原理：陽離子交換分離、柱后茚三酮衍生、可見光光度法測定。酮衍生、可見光光度法測定。 1.樣品必需樣品必需純純（97%以上）；以上）；2.測定蛋白質的測定蛋白質的分子量分子量；3.測定蛋白質由幾個測定蛋白質由幾個亞基亞基組成；組成；4.測定蛋白質的測定蛋白質的氨基酸組成氨基酸組成；并根；并根據(jù)分子量計算據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)每種氨基酸的個數(shù)。5.測定水解液中的測定水解液中的氨量氨量，計算，計算酰胺酰胺的含量。的含量。(1)、肽鏈的、肽鏈的拆開和分

25、離拆開和分離(2)、測定蛋白質分子中、測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目多肽鏈的數(shù)目(3)、二硫鍵二硫鍵的斷裂的斷裂(4)、測定測定每條多肽鏈每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比(5)、N端端、C端端的測定的測定(6)、多肽鏈斷裂多肽鏈斷裂(7)、測定每個肽段的氨基酸順序測定每個肽段的氨基酸順序(8)、確定肽段在多肽鏈中的次序、確定肽段在多肽鏈中的次序(9)、確定原多肽鏈中、確定原多肽鏈中二硫鍵的位置二硫鍵的位置測定每條測定每條多肽鏈的多肽鏈的氨基酸組氨基酸組成，并計成，并計算出氨基算出氨基酸成分的酸成分的分子比分子比。由多條多肽鏈組成的蛋白質分

26、子，必須由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為稱為寡聚蛋白質寡聚蛋白質，如血紅蛋白為四聚體，如血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體?？捎孟┐蓟笧槎垠w?？捎?mol/L尿素尿素或或6mol/L鹽酸胍鹽酸胍處理，即可分開多肽處理，即可分開多肽鏈鏈(亞基亞基)。通過通過測定末端氨基酸殘基的摩爾測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質分子量之間的關系數(shù)與蛋白質分子量之間的關系，即可，即可確定多肽鏈的數(shù)目。確定多肽鏈的數(shù)目。常用常用6mol/LHCl或或4mol/LH2SO4在在105-110條件下進行水解，反應時間

27、條件下進行水解，反應時間約約20小時小時。優(yōu)點是優(yōu)點是不容易引起水解產物的消旋化不容易引起水解產物的消旋化。缺點是缺點是Trp被沸酸完全破壞被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如含有羥基的氨基酸如Ser或或Thr有一小部有一小部分被分解；分被分解；Asn和和Gln側鏈的側鏈的酰胺基被酰胺基被水解成了羧基水解成了羧基。一般用一般用5 mol/L NaOH煮沸煮沸10-20小時小時。由于水解過程中由于水解過程中許多氨基酸都受到許多氨基酸都受到不同程度的破壞不同程度的破壞，產率不高。，產率不高。部分的水解產物發(fā)生部分的水解產物發(fā)生消旋消旋化。化。該法的優(yōu)點是該法的優(yōu)點是Trp在水解中不受破壞在水解中不受

28、破壞。 目前用于蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶（目前用于蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或稱蛋白酶）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。）已有十多種。 應用酶水解多肽應用酶水解多肽不會破壞氨基酸不會破壞氨基酸，也，也不會發(fā)生消旋化不會發(fā)生消旋化。水解的。水解的產物為較小的肽段產物為較小的肽段。 內切酶內切酶：胰蛋白酶、胰凝乳（糜）蛋白酶、：胰蛋白酶、胰凝乳（糜）蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶 外切酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶：羧肽酶和氨肽酶頜下腺蛋白酶頜下腺蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌V8V8

29、蛋蛋白酶白酶Asp-N-內切酶內切酶胃蛋白酶胃蛋白酶溴化氰溴化氰NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1胰蛋白酶胰蛋白酶（trypsin） R1=Lys（K）和）和Arg（R） 專一性較強，水解速度快專一性較強，水解速度快 R2=Pro（抑制）（抑制）水解位點水解位點NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1胃蛋白酶胃蛋白酶（pepsin） R1和和/或或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度較快水解速度較快 R1=Pro（抑制）（抑制） pH2NH CH COR4NH CH

30、 COR3NH CH COR2NH CH COR1糜蛋白酶糜蛋白酶/ /胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解位點水解位點 R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性等疏水性AA Leu、Met和和His稍慢稍慢 R2=Pro（抑制）（抑制） pH8-9NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶（thermolysin) R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的及其它疏水性強的AA水解速度較水解速度較快?？?。R2=Pro或或Gly，不水解，不水

31、解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解水解位點水解位點化學法化學法: （1）BrCN-Met的的C端端CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCNCH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內酯（2）NH2OH（羥胺）斷裂：（羥胺）斷裂：較專一性斷裂較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵之間的肽鍵Asn-Leu及及Asn-Ala鍵也能部分斷裂鍵也能部分斷裂 多肽鏈多肽鏈端基氨基酸端基氨基酸分為兩類：分為兩類：N-端端氨基酸氨基酸(amino-termi

32、nal)和和C-端端氨基酸氨基酸(carboxyl-terminal)。 在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。N末端：末端：1、Sanger法法2、Edman法法3、DNS-Cl4、酶降解法、酶降解法C末端：末端：1、肼解法肼解法2、酶降解法、酶降解法3、硼氫化鋰法、硼氫化鋰法幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在起，可在8mol/L尿素尿素或或6mol/L鹽酸鹽酸胍胍存在下，存在下，用用過量的過量的 -巰基乙醇處理巰基乙醇處理，使二硫鍵使二硫鍵還原為巰基還原為巰基，然后用，然后用烷基化烷基化試劑保護

33、生成的巰基試劑保護生成的巰基，以防止它重新，以防止它重新被氧化。被氧化。 1、過甲酸過甲酸performicacidCH2SO3H 2、還原氧化還原氧化巰基乙醇，巰基乙醇，DTT碘乙酸等碘乙酸等S-CH2-COOH 3、亞硫酸分解亞硫酸分解SulfitolysisR1-S-S-R2HSO3-R1-S-SO3H+R2-S-SO3H-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClOICH2CNH2O-OOC CHCH2SNH3+OCCH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+苯乙酰氯苯乙酰氯/ /碘乙酰胺碘乙酰胺可采用兩種或多種不同的斷裂方可采用兩種或多種不同的斷裂方法法( (如酶解、化學斷裂

34、等）如酶解、化學斷裂等）將多肽樣將多肽樣品斷裂成品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片兩套或多套肽段或肽碎片，并將其并將其分離分離開來。開來。1、蛋白質的分離純化、蛋白質的分離純化、二硫鍵的拆分與保護、二硫鍵的拆分與保護3、(亞基分離）亞基分離）4、多種方法的部分水解、多種方法的部分水解5、分離水解后得到的多肽、分離水解后得到的多肽6、測序、測序7、重疊、重疊8、二硫鍵位置的確定、二硫鍵位置的確定1、受空氣氧化而形成受空氣氧化而形成2、和和會發(fā)生交換反應會發(fā)生交換反應3、分析氨基酸組成時，、分析氨基酸組成時，Cys容易受修飾而容易受修飾而不利于定量不利于定量4、S-S鍵使蛋白酶難于作用鍵使蛋白酶難于作

35、用5、Edman反應中不能形成穩(wěn)定的反應中不能形成穩(wěn)定的PTH-AA6、多條肽鏈以多條肽鏈以S-S鍵相連，擁有兩個以鍵相連，擁有兩個以上上N末端，無法用末端，無法用Edman法測序法測序DABITC：有色有色Edman試劑試劑在在Edman試劑上加發(fā)色基團試劑上加發(fā)色基團pH9CF3COOH/無水DABITC:4-N,N-二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯4乙乙內酰硫脲內酰硫脲 瑞典人瑞典人,1916.4.14-1977.3.19 1946-47年在美國留學時想到改進年在美國留學時想到改進1930年年Abderhalden&Brockmann發(fā)明的發(fā)明的PITC試劑的反應試劑的反應,50年發(fā)明年發(fā)明

36、Edmandegradation反應反應. 1957年移居墨爾本年移居墨爾本,遠離國際學術中心開始遠離國際學術中心開始過過隱居生活隱居生活,1967年研制的自動化儀器可以達到年研制的自動化儀器可以達到每小時一每小時一個氨基酸的速度個氨基酸的速度;他堅持不申請專利他堅持不申請專利,給了美國公司得以給了美國公司得以隨便開發(fā)儀器的方便。隨便開發(fā)儀器的方便。1972年到德國，年到德國，1977年因腦瘤過年因腦瘤過世。世。 由于由于Edman降解產物需要在降解產物需要在紫外域進行檢測紫外域進行檢測,只有只有HPLC和相應的和相應的紫外檢測紫外檢測手段進步后才得到普及手段進步后才得到普及;60年代后期年代

37、后期Moore&Stein利用該反應測定了利用該反應測定了RNase的一級結構的一級結構,遺遺憾的是憾的是Edman沒有和他們分享沒有和他們分享Nobel化學獎化學獎.PTH-AA 序列序列 ABCDEFGHIJK- 酶解酶解 AB，CD，EF，GH，IJ， K EdmanEdman循環(huán)后再酶解循環(huán)后再酶解 BC，DE，F(xiàn)G，HI，JK，-質譜法質譜法 + + + Ry蛋白質吡啶蛋白質吡啶/3H2O/醋酸酐（醋酸酐（3:1:3,v/v）蛋白質蛋白質C末端末端C原子會被原子會被3H置換置換室溫室溫12h利用利用外切蛋白水解酶外切蛋白水解酶()將肽鏈的氨基酸從將肽鏈的氨基酸從N端端(氨肽酶氨肽酶，

38、)或或C端端(羧肽酶羧肽酶，)一個一個接一個游離出來，接一個游離出來，在不同時間取樣在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的游離的氨基酸的摩爾數(shù)摩爾數(shù)的多少來判斷氨基酸的排列的多少來判斷氨基酸的排列順序順序。C2F5COOHC2F5-COOOC-C2F5這兩種物質在這兩種物質在酸性條件下低溫反應酸性條件下低溫反應，可以，可以從從C端一個接一個地切除氨基酸端一個接一個地切除氨基酸，與質，與質譜相結合就可以確定譜相結合就可以確定C端多個氨基酸的序列。端多個氨基酸的序列。如果蛋白質分子中存在如果蛋白質分子中存在鏈間或鏈內二鏈間或鏈內二硫鍵硫鍵，在多肽鏈的氨基酸順序分析后，在多肽鏈

39、的氨基酸順序分析后，需要需要對二硫鍵的位置加以確定對二硫鍵的位置加以確定。確定二。確定二硫鍵的位置一般采用硫鍵的位置一般采用胃蛋白酶水解含二胃蛋白酶水解含二硫鍵的蛋白質硫鍵的蛋白質，因酶的專一性較低、切，因酶的專一性較低、切點多、生成的肽段包括點多、生成的肽段包括含有二硫鍵的肽含有二硫鍵的肽段較小段較小，便于后面的分離及鑒定；酶的，便于后面的分離及鑒定；酶的作用作用pH在酸性范圍（在酸性范圍（-2），有利于），有利于防止防止二硫鍵發(fā)生交換二硫鍵發(fā)生交換。 胃蛋白酶胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈 經(jīng)經(jīng)電泳分離電泳分離各肽段各肽段 用用過甲酸過甲酸斷開二硫鍵，含有斷開

40、二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質發(fā)的肽段帶電性質發(fā)生變化，轉向生變化，轉向90二次電泳二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化移率發(fā)生變化 然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。的位置。胃蛋白酶胃蛋白酶 最適最適pH約約2，此時二硫鍵不斷開，此時二硫鍵不斷開 專一性低、肽段短專一性低、肽段短H2N-CH-COOH CH2 S S CH2H2N-CH-COOH6HCOOOHH2N-CH-COOH CH2 SO3H H2N-CH-COOH CH2 SH2R-SH+6HCOOHR-S-S-R采用采用對角線電泳對角線電泳

41、(Brown及及Hartlay，1966)，將，將水解肽段點樣在濾紙上，水解肽段點樣在濾紙上，pH6.5條件進行條件進行第一向電泳第一向電泳，肽段按大小及電荷不同被分離肽段按大小及電荷不同被分離。然后將濾紙暴露在。然后將濾紙暴露在過過甲酸蒸氣甲酸蒸氣中，使中，使-S-S-斷裂，含二硫鍵的肽段斷裂，含二硫鍵的肽段被氧化成被氧化成一對含一對含半胱氨磺酸半胱氨磺酸的肽段的肽段。將濾紙旋轉。將濾紙旋轉90度，在與第度，在與第一向完全相同的條件下進行一向完全相同的條件下進行第二向電泳第二向電泳。結果是大多。結果是大多數(shù)肽段的遷移率未變，將位于濾紙的一條對角上。而數(shù)肽段的遷移率未變，將位于濾紙的一條對角上

42、。而含半胱氨磺酸對成對肽段比原來含二硫鍵的肽小并所含半胱氨磺酸對成對肽段比原來含二硫鍵的肽小并所帶負電荷增加，結果帶負電荷增加，結果偏離對角線偏離對角線。肽斑用茚三酮顯色。肽斑用茚三酮顯色確定。將每對含半胱氨磺酸對肽段分別取下（未用茚確定。將每對含半胱氨磺酸對肽段分別取下（未用茚三酮顯色），進行氨基酸序列分析，再與多肽的氨基三酮顯色），進行氨基酸序列分析，再與多肽的氨基酸順序比較，可推斷二硫鍵在鏈間或鏈內的位置。酸順序比較，可推斷二硫鍵在鏈間或鏈內的位置。對角線電泳技術對角線電泳技術a) a) 混合肽段點到濾紙?；旌想亩吸c到濾紙。b) b) 第一向電泳，將產物分第一向電泳，將產物分開。開。c) c) 用過甲酸將二硫鍵打斷用過甲酸將二硫鍵打斷d) d) 進行第二向電泳進行第二向電泳e) e) 偏離對角線的樣品就是偏離對角線的樣品就是含二硫鍵的片段含二硫鍵的片段DiagonalElectrophoresis斷裂蛋白質及斷裂蛋白質及測定肽段的序測定肽段的序列。首先列。首先測定測定氨基酸組成氨基酸組成及及N端氨基酸殘端氨基酸殘基基；如有二硫；如有二硫鍵，在肽鏈斷鍵，在肽鏈斷鏈前打開二硫鏈前打開二硫鍵；胰蛋白酶鍵；胰蛋白酶水解及肽段分水解及肽段分析；溴化氰水析；溴化氰水解及肽段分析；解及肽段分析；拼接整個肽段拼接整個肽段序列。序列。其他方法可