蛋白酶抑制劑的明膠聚丙烯酰胺凝膠電泳 ppt課件

1、一一. . 目的：目的：1.學習和掌握蛋白酶抑制劑電泳根本原理及電泳技術。2.熟練掌握蛋白酶抑制劑電泳有關試劑配制的技術和制膠技術。 二、原理：二、原理：( (一一).).聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGEPAGEPolyacrylamide Polyacrylamide gel electrophoresis gel electrophoresis: :是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。單體的丙烯酰胺單體的丙烯酰胺CH2=CHCONH2 AcrylamideCH2=CHCONH2 Acrylamide，簡

2、，簡稱稱AcrAcr甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,NCH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N- -methylenebisacrylamide,methylenebisacrylamide,簡稱簡稱BisBis聚合而成，這一聚合過程需求有自在基催化完成。聚合而成，這一聚合過程需求有自在基催化完成。 常用的催化聚合方法有兩種： 化學聚合和光聚合。 化學聚合:參與催化劑過硫酸銨NH4 2S2O3即AP以及加速劑四甲基乙二胺TEMED，四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自在基，這樣由于乙烯基“CH2=CH一個接一個的聚協(xié)作用就構(gòu)成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不

3、斷延伸的丙烯酰胺鏈間構(gòu)成甲叉鍵交聯(lián)，從而構(gòu)成交聯(lián)的三維網(wǎng)狀構(gòu)造。 氧氣對自在基有去除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進展抽氣。 光聚合:催化劑是核黃素，核黃素在光照下可以產(chǎn)生自在基，催化聚合反響。普通光照23小時即可完成聚合反響。 聚丙烯酰胺的根本構(gòu)造為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間經(jīng)過甲叉橋結(jié)合在一同。 鏈間縱橫交錯，構(gòu)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造，使凝膠具有分子篩性能。 網(wǎng)狀構(gòu)造還能限制蛋白質(zhì)等樣品的分散運動，使凝膠具有良好的抗對流作用。 長鏈上富含酰胺基團，使聚丙烯酰胺成為穩(wěn)定的親水凝膠。該構(gòu)造中不帶電荷，在電場中電滲景象極為微小。 這些特點使得聚丙烯酰胺特別適于作區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)。 聚丙烯酰胺凝

4、膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度T和交聯(lián)度C決議。 每100mL凝膠溶液中含有的單體(Acr,a)和交聯(lián)劑(Bis,b)總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T表示。 凝膠溶液中，交聯(lián)劑(Bis)占單體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis)總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度，用C %表示。 改動凝膠濃度T和交聯(lián)度C，可獲 得不同密度、粘度、彈性、機械強度和孔徑大小的 凝膠，以順應各種樣品的分別。 普通常用7.5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠分別蛋白質(zhì)， 用2.4%的分別核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸相對分子質(zhì)量的不同，適 用的濃度也不同。 富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的分量比應在30左右。選擇T和C的閱歷公式是：C = 6.50.3T 此式可用于計

5、算T為520時的凝膠組成。C值并不很嚴厲，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1，當C堅持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的添加而減小，當T堅持恒定，C為4時，有效孔徑最小，C大于或小于4時，有效孔徑均變大，C大于5時凝膠變脆，不宜運用，實驗中最常用的C是2.6和3。 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以經(jīng)過改動丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在330之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)沒有明顯的妨礙作用，可用于平板等電聚焦或SDSPAGE電泳的濃縮膠，也可以用于分別DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進展分別的電

6、泳中，如1020的凝膠常用于SDSPAGE電泳的分別膠。 配稱30的丙烯酰胺水溶液在4下能保管1個月，在儲存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而添加電泳時的電內(nèi)滲景象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時要防止直接接觸皮膚，但它們聚合后那么無毒。 由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點，因此四十年來得到廣泛的運用，目前尚無更好的支持介質(zhì)可以取代它。其主要的優(yōu)點有：可以隨意控制膠濃度“T和交聯(lián)度“C，從而得到不同的有效孔徑，用于分別不同分子量的生物大分子。能把分子篩作用和電荷效應結(jié)合在同一方法中，到達更高的靈敏度：109 1012 mol/L。由于聚丙烯酰胺凝膠是由C

7、C鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只需不活潑的酰胺基CONH2 ，沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產(chǎn)生“電滲。由于可以制得高純度的單體原料，因此電泳分別的反復性好。透明度好，便于照相和復印。機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保管。無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。還可以用作固定化酶的惰性載體。 ( (二二).).影響電泳遷移率的要素影響電泳遷移率的要素電場強度電場強度 電場強度是指單位長度電場強度是指單位長度cmcm的電位降，也的電位降，也稱電勢稱電勢梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中，電極中，電極液與濾紙交

8、界面的紙長為液與濾紙交界面的紙長為20cm20cm，測得的電位降為，測得的電位降為200V200V，那，那么電場強度為么電場強度為200V/20cm200V/20cm10V/cm10V/cm。當電壓在。當電壓在500V500V以下，以下，電場強度在電場強度在2-10v/cm2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在時為常壓電泳。電壓在500V500V以上，電以上，電場強度在場強度在20-200V/cm20-200V/cm時為高壓電泳。電場強度大，時為高壓電泳。電場強度大，帶電質(zhì)帶電質(zhì)點的遷移率加速，因此省時，但因產(chǎn)生大量熱量，點的遷移率加速，因此省時，但因產(chǎn)生大量熱量，應配備應配備冷卻安裝以維持恒溫

9、。冷卻安裝以維持恒溫。溶液的溶液的pHpH值值 溶液的溶液的pHpH決議被分別物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點決議被分別物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點的帶電性的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子，它是既有質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子，它是既有酸性基團酸性基團-COOH-COOH，又有堿性基團，又有堿性基團-NH2-NH2的兩性電解質(zhì)，的兩性電解質(zhì)，在某在某一溶液中所帶正負電荷相等，即分子的凈電荷等一溶液中所帶正負電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此于零，此時，蛋白質(zhì)在電場中不再挪動，溶液的這一時，蛋白質(zhì)在電場中不再挪動，溶液的這一pHpH值值為該蛋白為該蛋白質(zhì)的等電點質(zhì)的等電點Isoelctric point

10、Isoelctric point，pIpI。假設溶。假設溶液液pHpH處于等處于等電點酸側(cè)，即電點酸側(cè)，即pHpHpIpI，那么蛋白質(zhì)帶正電荷，在，那么蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負電場中向負極挪動。假設溶液極挪動。假設溶液pHpH處于等電點堿側(cè)，即處于等電點堿側(cè)，即pHpHpIpI，那么蛋白質(zhì)那么蛋白質(zhì)帶負電荷，向正極挪動。溶液的帶負電荷，向正極挪動。溶液的pHpH離離pIpI越遠，質(zhì)越遠，質(zhì)點所帶凈點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應根據(jù)樣品根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇適宜的性質(zhì)，選擇適宜的pHpH值緩沖液。值緩沖液。溶液的離子強度溶液的離子強度

11、 電泳液中的離子濃度添加時會引起質(zhì)點遷移率電泳液中的離子濃度添加時會引起質(zhì)點遷移率的降低。的降低。其緣由是帶電質(zhì)點吸引相反符合的離子聚集其周其緣由是帶電質(zhì)點吸引相反符合的離子聚集其周圍，構(gòu)成圍，構(gòu)成一個與運動質(zhì)點符合相反的離子氛一個與運動質(zhì)點符合相反的離子氛ionic atmosphere，離子氛不僅降低質(zhì)點的帶電量，離子氛不僅降低質(zhì)點的帶電量，同時添加同時添加質(zhì)點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子質(zhì)點前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的持溶液的pH值，影響質(zhì)點的帶電量，改動泳動速度。

12、離子值，影響質(zhì)點的帶電量，改動泳動速度。離子的這種障的這種障礙效應與其濃度和價數(shù)相關?？捎秒x子強度礙效應與其濃度和價數(shù)相關。可用離子強度I表示。表示。式中S表示溶液中離子種類，Ci和Zi分別表示每種離子的摩爾濃度與化合價。最常用I值在0.02-0.2之間。電滲電滲 在電場作用下液體對于固體支持物的相對挪在電場作用下液體對于固體支持物的相對挪動稱為電動稱為電滲滲(Electro-osmosis)(Electro-osmosis)。其產(chǎn)生的緣由是固體支持。其產(chǎn)生的緣由是固體支持物多物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液中的正離中的正離子或負離子，使

13、溶液相對帶負電或正電。如以濾子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持紙作支持物時，紙上纖維素吸附物時，紙上纖維素吸附OH-OH-帶負電荷，與紙接觸的帶負電荷，與紙接觸的水溶液水溶液因產(chǎn)生因產(chǎn)生H3O+H3O+，帶正電荷移向負極，假設質(zhì)點原來，帶正電荷移向負極，假設質(zhì)點原來在電場中移在電場中移向負極，結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，向負極，結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，假設質(zhì)點假設質(zhì)點原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應盡可見應盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。5.5.焦

14、耳熱焦耳熱 電泳過程中釋放的熱量與電流的平方成正比，電泳過程中釋放的熱量與電流的平方成正比，當電極當電極緩沖液中離子強度添加時，電流強度會隨之添加，緩沖液中離子強度添加時，電流強度會隨之添加，這不僅這不僅降低分辨率，而且在嚴重時會燒斷濾紙或融化瓊降低分辨率，而且在嚴重時會燒斷濾紙或融化瓊脂糖凝膠脂糖凝膠支持物。支持物。6.6.篩孔篩孔 支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快；反之，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動速度快；反之，那么泳動速那么泳動速度慢。除上述影響泳動速度的因子外，溫度和儀度慢。除上述影響泳動速度

15、的因子外，溫度和儀器安裝等器安裝等對泳動速度的影響也應思索。對泳動速度的影響也應思索。( (三三).).蛋白酶抑制劑電泳活性染色的原理：蛋白酶抑制劑電泳活性染色的原理： 分別純化蛋白酶抑制劑時，常采用對其靶蛋分別純化蛋白酶抑制劑時，常采用對其靶蛋白酶的抑白酶的抑制活性來進展檢測和追蹤。由于植物資料中蛋白制活性來進展檢測和追蹤。由于植物資料中蛋白酶抑制劑酶抑制劑含量較少，而測定抑制活性的方法復雜、費時，含量較少，而測定抑制活性的方法復雜、費時，需求人工需求人工合成的特殊底物，因此不太方便。合成的特殊底物，因此不太方便。 根據(jù)蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶的作用特點，根據(jù)蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶的作用特點，

16、采用明膠采用明膠PAGEPAGE，分別膠中參與，分別膠中參與0.5% 0.5% 明膠作為靶蛋白酶的明膠作為靶蛋白酶的底物，底物，電泳后膠板含明膠底物在靶蛋白酶進展酶解電泳后膠板含明膠底物在靶蛋白酶進展酶解時，除了時，除了蛋白酶抑制劑存在處的明膠不被酶解，膠板中其蛋白酶抑制劑存在處的明膠不被酶解，膠板中其他位置的他位置的明膠均被蛋白酶水解。酶解后再經(jīng)水沖洗干凈凝明膠均被蛋白酶水解。酶解后再經(jīng)水沖洗干凈凝膠，然后膠，然后再經(jīng)考馬斯亮藍再經(jīng)考馬斯亮藍R250R250染色，顯色帶蛋白帶為染色，顯色帶蛋白帶為靶蛋白酶靶蛋白酶抑制劑的作用效果抑制劑抑制蛋白酶活性從而抑制劑的作用效果抑制劑抑制蛋白酶活性從而

17、使明膠不使明膠不被水解部位。采用不同靶蛋白酶可以檢測同一被水解部位。采用不同靶蛋白酶可以檢測同一植物中不植物中不同的蛋白酶抑制劑。同的蛋白酶抑制劑。三三. . 實驗資料實驗資料胰蛋白酶抑制劑：來自紅豆提取液，經(jīng)80鹽析的上清液、Sephadex-G100柱層析。規(guī)范胰蛋白酶抑制劑國產(chǎn)。大約蛋白酶抑制劑的點樣范圍：抑活為110U都可以出帶。電泳的樣品：0.51mL/樣品/班15l/孔四四. . 儀器設備儀器設備 1.DDY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ23A型電泳槽垂直平板電泳槽2.恒溫箱3.水浴鍋：調(diào)37或504.冰箱5.脫色搖床6.移液管或移液器5mL(1)、1mL(2)、0.1mL17.微

18、量注射器50uL1五五. . 玻璃器皿以組為單位玻璃器皿以組為單位100 mL燒杯3，吸管1、玻棒1， 濾紙36，試劑瓶1000 mL、500 mL、250 mL等、培育皿。六六. . 實驗試劑實驗試劑一試劑預備：一試劑預備：丙烯酰胺丙烯酰胺AcrAcr、甲叉雙丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)、過硫、過硫酸酸銨、濃銨、濃HClHCl、TrisTris、氫氧化鈉、蔗糖、冰醋酸、氫氧化鈉、蔗糖、冰醋酸、TEMEDTEMED、考馬斯亮藍、考馬斯亮藍R250R250、NaClNaCl、CaCl2CaCl2、甲醇、甲醇、甲甲醛、明膠、溴酚藍、胰蛋白酶國產(chǎn)醛、明膠、溴酚藍、胰蛋白酶國產(chǎn)( (二

19、二) ) 電泳部分的凝膠制備方法電泳部分的凝膠制備方法1 1、30%30%凝膠貯液：取凝膠貯液：取60g60g丙烯酰胺丙烯酰胺AcrAcr、1.6g1.6g甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)。先用約。先用約100 mL100 mL蒸餾水溶蒸餾水溶解，如溶解不了解，如溶解不了, ,可加熱可加熱30oC-50oC30oC-50oC溶解溶解, ,再用量再用量筒定容至筒定容至200mL200mL，然后過濾，后置于棕色瓶。，然后過濾，后置于棕色瓶。44下保管備用。全班下保管備用。全班200mL200mL2 2、10%10%過硫酸銨過硫酸銨(AP)(AP)溶液：取溶液：取2g2g過硫酸銨溶解

20、后，過硫酸銨溶解后，定容至定容至20mL20mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，現(xiàn)配現(xiàn)用. .3 3、1 mol/L HCl 500mL1 mol/L HCl 500mL：在通風櫥取濃：在通風櫥取濃HCl 42 HCl 42 mLmL，加蒸餾水至，加蒸餾水至500 mL500 mL。4 4、分別膠緩沖溶液、分別膠緩沖溶液1.5mol/L Tris1.5mol/L TrisClCl緩沖液，緩沖液，pH8.8pH8.8：?。喝?6.3g Tris36.3g Tris三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷溶解后，加溶解后，加1mol/L HCl1mol/L HCl溶液約溶液約96 mL 96 mL ，調(diào)，調(diào)pHpH至至8.8

21、8.8，定容至，定容至200mL200mL。 全班全班200mL200mL5、濃縮膠緩沖液(0.5mol/L TrisHCl緩沖液，pH6.8)：取6g Tris三羥甲基氨基甲烷溶解后，加1mol/L HCl溶液約40 mL，調(diào)pH至6.8，定容至100mL。 6、電極緩沖液0.05 mol/L Tris0.384 mol/L甘氨酸緩沖液，pH8.3：取Tris三羥甲基氨基甲烷6g、28.8g甘氨酸(氨基乙酸)，加水溶解后,測定pH8.3，定容至。用時稀釋倍。全班5000mL任務液7、25明膠：稱取25g明膠，參與10mL蒸餾水，溶解混勻后低溫保管。 (假設難以溶解可于37水浴中攪拌溶解)。8

22、、0.5溴酚藍指示劑：配50mL。9、10% 四甲基乙二胺TEMED20mL。( (三三) ) 酶解和脫酶部分的試劑制備方法電泳過酶解和脫酶部分的試劑制備方法電泳過程中再配。程中再配。1 1、0.5 mol/L HCl0.5 mol/L HCl：全班配：全班配200 mL200 mL2 2、0.05mol/L Tris-HCl0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5pH7.5內(nèi)含內(nèi)含0.2mol/LNaCl0.2mol/LNaCl， 0.01mol/LCaCl20.01mol/LCaCl2： 取取6.05 g6.05 g三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷TrisTris、80.6mL 8

23、0.6mL 0.5 mol/L0.5 mol/L鹽酸鹽酸, , 參與參與12.5g NaCl12.5g NaCl和和1g CaCl21g CaCl2，加水定容至加水定容至1000mL1000mL，用試紙檢測，用試紙檢測pH7.5pH7.5。3 3、100 U/mL100 U/mL的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液0.2 mg/mL0.2 mg/mL： 稱取稱取20mg20mg胰蛋白酶，用胰蛋白酶，用0.05mol/L Tris-HCl0.05mol/L Tris-HCl，pH7.5pH7.5內(nèi)含內(nèi)含0.2mol/LNaCl0.2mol/LNaCl，0.01mol/LCaCl20.01mol/LCaCl2

24、定容到定容到100mL100mL。( (四四) ) 染色和脫色部分的試劑制備方法電泳過染色和脫色部分的試劑制備方法電泳過程中再配。程中再配。1 1、考馬斯亮藍、考馬斯亮藍R250R250染色液染色液0.1%0.1%考馬斯亮藍考馬斯亮藍-45%-45%甲醇甲醇-10%-10%冰乙酸溶液：冰乙酸溶液：1g1g考馬斯亮藍考馬斯亮藍R250R250，參，參與與450 mL 450 mL 甲醇、甲醇、100mL100mL冰乙酸，用水定容至冰乙酸，用水定容至1000 1000 mLmL。過濾后運用。過濾后運用。2 2、0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl脫色液，脫色液，2000mL2000

25、mL。3 3、 5%5%氨水：將氨水原液和水以氨水：將氨水原液和水以1 1：4 4的比例稀釋。的比例稀釋。七實驗步驟七實驗步驟一、電泳凝膠的制造一、電泳凝膠的制造1 1、清洗玻璃板、清洗玻璃板; ;2 2、在塑料膠條兩面涂少量凡士林留意不能涂多，、在塑料膠條兩面涂少量凡士林留意不能涂多，以防弄臟玻璃板；以防弄臟玻璃板；3 3、安裝好電泳槽玻璃板；、安裝好電泳槽玻璃板；4 4、用小燒杯按下表、用小燒杯按下表1 1配封膠液，用滴管滴加于封配封膠液，用滴管滴加于封口槽處，靜置約口槽處，靜置約5-105-10分鐘直到凝固。分鐘直到凝固。5 5、參與水于兩層玻璃之間，檢查玻璃底能否漏水；、參與水于兩層玻

26、璃之間，檢查玻璃底能否漏水；假設漏水假設漏水, ,要重裝。要重裝。6、用小燒杯按下表1配下層膠分別膠，膠濃度13，混勻，灌膠，高度離梳子約11.5cm，然后覆蓋一層水，凝膠時間為15-30分鐘，膠與水分層，傾倒去水。7、小燒杯按上表配上層膠濃縮膠，膠濃度，混勻，灌膠，插入梳子；8、在凝膠過程中，液面下降，要補充膠液，凝膠時間約10-20分，凝好膠，拔掉梳子；9、參與稀釋的電極緩沖液,浸泡至上槽低玻璃面,但不能高過下槽低玻璃面,留意不能漏水。封膠 分離膠13% 濃縮膠5% 凝膠貯液30%（mL） 2 2.2 0.81 上層膠緩沖液pH6.8（mL） 0 0 2.5 下層膠緩沖液pH8.8（mL）

27、 0 1.25 010TEMED（四甲基乙二胺）（L） 200 50 100水（mL）61.451.55明膠(L) 0 100 AP（過硫酸氨）（L） 100 100 100總體積（mL） 8.3 5.15 5.01凝膠時間 （5min凝膠）凝膠） （15-20min凝膠）凝膠）（10min凝膠）凝膠）二、電泳的過程二、電泳的過程1 1、點樣前，樣品要加、點樣前，樣品要加2020蔗糖蔗糖20ul20ul以添加比重，以添加比重，同時加同時加0.050.05的溴酚蘭的溴酚蘭10ul10ul指示劑，按下表指示劑，按下表2 2點點樣，用微量注射器點樣，每點樣，用微量注射器點樣，每點1 1個樣品，都要清

28、個樣品，都要清洗微量注射器，留意不要交叉污染。洗微量注射器，留意不要交叉污染。2 2、將電泳槽上槽低玻璃面接，下槽、將電泳槽上槽低玻璃面接，下槽高玻璃面接，高玻璃面接， 恒電壓電泳：恒電壓電泳： 濃縮膠，濃縮膠， 100V 100V ，約，約 1h 1h ；分別膠，；分別膠， 160V 160V ，約，約 3-4h3-4h。指。指示劑離下面膠剩示劑離下面膠剩1cm1cm左右停頓電泳。左右停頓電泳。3 3、剝膠。留意，不要把膠弄碎。、剝膠。留意，不要把膠弄碎。1234567891011名稱鹽析過柱1標準過柱2過柱3體積（ul） 1010101010三、電泳后的活性染色三、電泳后的活性染色1 1、電泳終了，取出膠板置于培育皿中，用去離子、電泳終了，取出膠板置于培育皿中，用去離子水沖洗數(shù)次，將膠板浸在含水沖洗數(shù)次，將膠板浸在含0.2 mg/mL0.2 mg/mL胰蛋白酶胰蛋白酶0.05mol/LTris-HCl0.05m