酸奶中乳酸菌的分離檢測及純化

1、酸奶中乳酸菌的分離檢測及純化酸奶中乳酸菌的分離檢測及純化組員：王應龍 王英剛 王志軍 吳曉慶 武正芳 2012年11月【實驗目的】 1、了解和掌握乳酸菌菌的菌種特性 2、掌握乳酸菌的分離檢測及純化方法【實驗原理】【實驗原理】 乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。根據(jù)細胞形態(tài)為球狀或桿狀，可分為兩大類，即乳酸鏈球菌族（Streptococceae）和乳酸桿菌（Lactobacilleae）。 在1.6%溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，乳酸菌菌落大約1-3 mm，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)

2、酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈。乳酸菌革蘭氏染色后呈藍紫色?！緦嶒灢牧稀x器與試劑】【實驗材料、儀器與試劑】實驗材料：市售乳酸飲料或酸奶。實驗儀器：保溫箱、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋、 培養(yǎng)皿、試管、涂布器、酒精燈等。實驗試劑：脫脂乳試管、脫脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 瓊脂、無菌水【實驗步驟】【實驗步驟】1、1.6%溴鉀酚紫牛乳培養(yǎng)基的制備2、脫脂乳試管的制備3、酸奶中乳酸菌的分離4、乳酸菌的檢測、純化培養(yǎng)（1 1）、）、1.6%1.6%溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基的制備溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基的制備配料：配料：（A）液：脫脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲

3、酚紫、乙醇溶液1ml， 80滅菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，瓊脂20g ，pH6.8， 121濕熱滅菌20min。操作：操作：（1）、按照配方正確稱取所需藥品放于燒杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解，用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，加瓊脂溶化，加熱過程要不斷攪拌，可適當補水。瓊脂完全溶解后 倒入250mL的錐形瓶中，貼上標簽，在高壓鍋中滅菌20min。（2）、滅好菌的A液和B液趁熱充分混合，并在酒精燈的附近趁熱倒平板。（2 2）、脫脂乳試管的制備）、脫脂乳試管的制備 直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10g與蔗糖5g，水95g（蔗糖與水的比例在1：10的范

4、圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115滅菌15min。（3 3）、乳酸飲料或酸奶中乳酸菌的分離）、乳酸飲料或酸奶中乳酸菌的分離（1 1）、酸奶菌懸液的配制）、酸奶菌懸液的配制 取1個潔凈三角瓶，盛以90ml無菌水；7支試管，各盛9ml的無菌水；加塞包扎于在103kPa 121高壓蒸汽滅菌20Min。 將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品10ml加入盛有90ml無菌水的三角瓶中，振搖均勻，即為10-1的樣品稀釋液。 將7只裝9ml無菌水的無菌試管，依次編號1-7，再用無菌移液管吸10-1的菌懸液1ml放入依次裝有9ml無菌水的試管1-6中，稀釋混勻便得到10-210-7的稀釋液。酸

5、奶菌懸液的配制 另留一管不稀釋留作對照（另留一管不稀釋留作對照（CK）10-310-410-510-610-210-79ml無菌水 9ml無菌水 9ml無菌水 9ml無菌水 9ml無菌水 9ml無菌水90ml無菌水10-1花園酸奶10ml10ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml（2 2）、分離方法）、分離方法 A平板劃線 接種環(huán)挑取10-1菌液，按無菌操作對標有”10-1”的3個平板進 行劃操作；劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置放在40恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48小時。B平板涂布 用無菌移液管分別吸取10-5、10-6

6、、10-7和無菌生理鹽水的稀釋菌懸液各1ml，對號接種于與之對應的無菌溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基平板中；盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于試驗臺上20 min；然后倒置于40恒溫箱中培養(yǎng)48小時。（4 4）、乳酸菌的檢測、純化培養(yǎng)）、乳酸菌的檢測、純化培養(yǎng) (1)(1)、初步檢測、初步檢測 恒溫培養(yǎng)48小時過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)進行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。（2 2）、乳酸菌的分離純化培養(yǎng)）、乳酸菌的

7、分離純化培養(yǎng) 選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40培養(yǎng)8-24h若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌種待用?！咀⒁馐马棥俊咀⒁馐马棥?采用溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌時，注意挑取典型特征的黃色菌落，結(jié)合鏡檢觀察，有利高效分離篩選乳酸菌?！窘Y(jié)果與分析】【結(jié)果與分析】1、接種不同濃度菌懸液培養(yǎng)基中乳酸菌落數(shù)稀釋度稀釋度1010-5-51010-6-61010- -7 7CKCK對照對照平板平板1 12 23 31 12 23 31 12 23 31 12 23 3菌落數(shù)菌落數(shù)263245281161140138978473233各濃度平各濃度平均菌落數(shù)均菌落數(shù)26426414614685853 3平均菌落平均菌落數(shù)（減去數(shù)（減去CKCK后）后）1.46X10-72、革蘭氏染色結(jié)果革蘭氏染色結(jié)果為藍紫色，證乳酸菌為革蘭氏陽性菌革蘭氏染色結(jié)果為藍紫色，證乳酸菌為革蘭氏陽性菌3、脫脂乳試管檢測乳酸桿菌試管中脫脂牛乳凝固，證為乳酸桿菌試管中脫脂牛乳凝固，證為乳酸桿菌4 4、初步結(jié)果、初步結(jié)果通過實驗