Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 定義：n印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。n1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。n而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法Western Blot基本原理基本原理 在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種

2、固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。n蛋白樣品的制備nSDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色 蛋白樣品的定量Bradford法 考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ 將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/

3、ml, 0.5mg/ml。）管號(hào)012345678ddH2O807070707070707070蛋白標(biāo)準(zhǔn)液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電

4、價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過(guò)硫酸銨(時(shí)間)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉(zhuǎn)膜半干法半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過(guò)夜。 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。

5、只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過(guò)程。 一抗、二抗孵育n把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時(shí)，4 過(guò)夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。n加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 37一小時(shí)，4 過(guò)夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。 辣根過(guò)氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（AP） 化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)？ 背景太高膜沒(méi)有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過(guò)高 原原因因?qū)?duì)策策轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)