僅供參考~分子生物學(xué)復(fù)習(xí)

1、第二章 染色體與DNA（一）真核細胞染色體與原核細胞染色體的主要區(qū)別：比較項目真核細胞染色體原核細胞染色體數(shù)量多一般只有一條位置位于細胞核的核仁位于擬核組成方式真核染色體的DNA與蛋白質(zhì)完全融合在一起原核染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)（二）原核生物與真核生物基因組的特點原核生物：1.結(jié)構(gòu)簡練；2.存在轉(zhuǎn)錄單元：多順反子；3.有重疊基因真核生物:1. 含有大量重復(fù)序列：不重復(fù)序列：只有一個或幾個拷貝，多為結(jié)構(gòu)基因，功能基因中度重復(fù)序列：重復(fù)101000個拷貝，rRNA、tRNA及一些結(jié)構(gòu)基因。高度重復(fù)序列：衛(wèi)星DNA、反向重復(fù)序列等，不轉(zhuǎn)錄。 2.功能DNA序列大多被非功能DNA所隔開（外顯子和內(nèi)含子

2、）3.存在C值矛盾（三） 染色體的組裝1.核小體的組成成分？由核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩分子生成的八聚體和由200bp的DNA組成。 2.核小體是如何一步一步組裝成染色體的？整個過程中的壓縮情況如何？ 形成核小體后,其長度被壓縮了7倍形成螺線管后,DNA長度又被壓縮了6倍由螺線管形成超螺線管后,DNA的長度又被壓縮了40倍形成染色單體后,DNA的長度又被壓縮了5倍。因此由一條DNA長鏈,經(jīng)過多級螺旋化,可以使幾厘米長的DNA與組蛋白等物質(zhì)共同形成幾微米長的染色體,其長度總共被壓縮了800010000倍。 （四）DNA復(fù)制的幾個基本原則1.半保留復(fù)制：DNA生物合成時，母鏈DNA雙

3、螺旋結(jié)構(gòu)解開而成為單鏈，各自作為模板，按照堿基互補原則，合成與模板互補的子鏈。這樣子代細胞的DNA雙鏈，其中一股單鏈是從親代完整地接受過來的，另一股單鏈則完全重新合成，兩個子細胞的DNA都與親代DNA堿基序列一致2.半不連續(xù)復(fù)制：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3 5方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5 3 方向連續(xù)合成，另一股以5 3 為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以 5 3方向合成10002000個核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段），這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。岡崎片段：DNA復(fù)制時，一股以5 3方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈沿5 3合成10002000個核苷酸不連續(xù)的小片段

4、稱之為崗崎片段。崗崎片段由DNA連接酶連成一條完整的新鏈。前導(dǎo)鏈：DNA復(fù)制時，一股以3 5方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈以5 3方向連續(xù)合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向一致）隨從鏈：DNA復(fù)制時，一股以5 3方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈沿5 3合成，10002000個核苷酸不連續(xù)的小片段的鏈稱為隨從鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向相反)3.RNA引物：提供3-OH，減少突變，提高DNA復(fù)制的真實性4.復(fù)制的真實性的保證：DNA的半保留復(fù)制；遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；復(fù)制出錯時有即時的校讀功能(3 5外切酶功能）；DNA損傷的修復(fù)機制；RNA引物（DNA復(fù)制開始時摻入的核苷酸往往容易出

5、錯，加在RNA引物中可以被切除，不會影響DNA的準確性 ）（一）DNA復(fù)制過程（原核生物為例，掌握過程）（起始、延長、終止）1.確定復(fù)制的起始點復(fù)制有固定的起始點，稱為ori；oriC的跨度為245 bp，有特定的堿基順序3組串聯(lián)重復(fù)序列識別區(qū)；2對反向重復(fù)序列AT rich區(qū)（容易解鏈）2.解開雙鏈DNA,提供單鏈DNA模板DNA解成單鏈，提供模板形成引發(fā)體及合成引物提供3-OH末端解鏈過程：由拓撲異構(gòu)酶I的作用下解開負超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點處解開雙鏈；SSB在一定時間內(nèi)使復(fù)制叉保持適當長度，穩(wěn)定解開的單鏈。3.形成復(fù)制叉：復(fù)制時，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進行，所以，這個

6、復(fù)制起點呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉。4.DNA合成的起始和延長：DNA合成的起始：拓撲異構(gòu)酶松馳螺旋引發(fā)體和引物：復(fù)制過程需要引物 短鏈RNA；引發(fā)前體與六種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并與引發(fā)酶共同形成引發(fā)體。在適當位置上，引物酶依據(jù)模板的堿基序列，從5 ® 3 方向催化NTP聚合，生成短鏈RNA引物DNA-pol 催化下，引物的3-OH末端與新鏈的第一個dNTP形成磷酸二酯鍵，開始復(fù)制。復(fù)制的延長：指在DNA-pol的催化下，以母代單鏈DNA為模板，按照堿基互補原則，dNTP以dNMP的方式逐個加入而延長子代DNA新鏈，其化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。5.形成帶有新合成的DNA片段的復(fù)

7、制泡6.復(fù)制的終止：去除RNA引物DNA聚合酶的小片段5 3外切酶補充空缺DNA聚合酶的大片段3 5外切酶； 5 3聚合酶連接DNA連接酶 （二）解開成單鏈的過程中，拓撲異構(gòu)酶、解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白分別起什么作用？ 1拓撲異構(gòu)酶I：切斷DNA單鏈和解旋后或再螺旋后連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 拓撲異構(gòu)酶II：切斷DNA雙鏈和解旋后或再螺旋后連接，作用是將負超螺旋引入DNA分子，同復(fù)制有關(guān)。2解旋酶：解開DNA雙鏈，每個bp消耗2個ATP3單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：與單鏈DNA結(jié)合,維持單鏈狀態(tài) ，使其不受核酸酶水解，避免單鏈DNA自身發(fā)夾螺旋形成，使前端螺旋易解開

8、。復(fù)制叉：復(fù)制時，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進行，所以，這個復(fù)制起點呈現(xiàn)叉子的形式，被稱為復(fù)制叉復(fù)制子：DNA的復(fù)制是由固定的起始點開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個復(fù)制子只含一個復(fù)制起點。無論是原核生物還是真核生物，DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點以雙向等速復(fù)制方式進行的。 線性DNA雙鏈的復(fù)制和環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制的常見復(fù)制類型 （三）大腸桿菌的DNA聚合酶I和III的特點DNA聚合酶IDNA聚合酶III多功能酶 53外切酶53外切酶53聚合酶多功能酶53聚合酶 35外切酶單鏈多肽大小二個片段不對稱二聚體切除RNA引物，填補空缺損傷后修復(fù)DNA 復(fù)制的主要酶高續(xù)進性高聚合酶活

9、性高產(chǎn)物真實性端粒： 位于真核生物染色體末端（一條鏈的3¢-OH），由蛋白質(zhì)和DNA（人類：“TTAGGG”重復(fù)序列）緊密結(jié)合的結(jié)構(gòu)。特征: 3端是由數(shù)百個串聯(lián)重復(fù)G豐富的6個核苷酸組成端粒酶（唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶）：防止端粒縮短的酶，能不斷地延長染色體末端已縮短的端粒，由蛋白質(zhì)(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)組成。端粒復(fù)制過程：本身提供RNA模板，再逆轉(zhuǎn)錄，延長母鏈，然后反皺-爬行模型（四）DNA的損傷修復(fù)1. DNA損傷原因：復(fù)制錯誤、DNA重組、物理化學(xué)因子損傷部位：堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵2DNA損傷修復(fù)的類型：錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、

10、DNA直接修復(fù)DNA轉(zhuǎn)座：一段DNA順序可以從原位上單獨復(fù)制或斷裂下來，環(huán)化后插入另一位點，并對其后的基因起調(diào)控作用，此過程稱轉(zhuǎn)座。這段序列稱跳躍基因或轉(zhuǎn)座子。麥克林托克(B. McClintock)因首先在玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子而獲得了1983年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。轉(zhuǎn)座子的種類：插入序列、類插入序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、 TnA家族 第三章 生物信息的傳遞(上) 轉(zhuǎn)錄（從DNA-RNA）基本概念：轉(zhuǎn)錄：生物體以DNA的一條鏈為模板，按照堿基配對原則，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補的RNA鏈，這個過程稱為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈：與RNA序列相同的那條DNA鏈，又稱正(+) 鏈、有意義鏈

11、模板鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱，又稱負(-)鏈 、反意義鏈不對稱轉(zhuǎn)錄：在多基因的雙鏈DNA分子中，每個基因的模板不是全在同一條鏈上，也就是在雙鏈DNA分子中的一條鏈，對于某基因是有義鏈，但對另一個基因則可能是反義鏈。這就是我們所說的不對稱轉(zhuǎn)錄，即模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。不對稱轉(zhuǎn)錄。它有兩方面含義：一是在DNA雙鏈分子上，相對某基因來說，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非永遠在同一單鏈上一、幾種類型的RNA：含量及作用1，信使RNA(mRNA)：它占全部RNA的5%左右。大腸桿菌中占總RNA的2%。2，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)：tRNA在全部RNA中約占15%，種類在40種以

12、上3，核糖體RNA(rRNA)： rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成核糖體。在大腸桿 菌中，rRNA占細胞總RNA的75%85% 。除了上述3種主要的RNA外，還有一些類型的RNA 二、轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同 相同：模板，新鏈延伸方向，堿基的加入原則。相異：引物。信息全保留與信息半保留。底物、與T配對的堿基模板的數(shù)量（一條與兩條）。所需要的酶，及酶的外切活性的有無。三、大腸桿菌RNA聚合酶的組成1，E. coli RNA聚合酶的核酶：由2 組成。作用：參與轉(zhuǎn)錄的全過程，但不能精確起始2. E. coli RNA聚合酶的全酶：核酶因子因子負責(zé)模板鏈的選擇與轉(zhuǎn)錄的起始。不僅能增加聚合酶對啟動

13、子的親和力，還降低它對非專一位點的親和力。 功能 2個亞基 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 核心酶 1個亞基 結(jié)合底物，形成磷酸二酯間（催化）全酶 1個亞基 結(jié)合模板（開鏈）1個亞基 識別起始點啟動子(延長是脫落) RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別 RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5 33 5校對合成能力無有修復(fù)能力無有相關(guān)概念：啟動子：位于結(jié)構(gòu)基因5，端上游的一段DNA序列，能被RNA聚合酶識別,結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列

14、轉(zhuǎn)錄起點：指RNA開始轉(zhuǎn)錄的第一個堿基，此點通常用+1表示上游：轉(zhuǎn)錄起點的左側(cè)，用負的數(shù)碼表示 下游：轉(zhuǎn)錄起點右側(cè)（轉(zhuǎn)錄區(qū)），用正的數(shù)碼表示 轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit)：一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的DNA序列.在細菌中，一個轉(zhuǎn)錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。 足跡法與啟動子: 啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。利用DNase 足跡法和DNA測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu)。DNase 足跡法的基本原理與DNA 化學(xué)測序法有些相似. 首先將待測雙鏈DNA 片段中一條單鏈的一端選擇性地進行末端標記, 然后加入恰當濃度的DNase , 使在DNA

15、 鏈上隨機形成缺口, 經(jīng)變性后電泳分離, 放射自顯影, 即可形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA 條帶. 但當DNA 片段與相應(yīng)的序列特異性DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合后, DNA 結(jié)合蛋白可保護相應(yīng)的DNA 序列不受DNase 的攻擊, 因而在放射自顯影圖譜上, DNA 梯度條帶在相應(yīng)于DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷, 從而形成一空白區(qū)域, 恰似蛋白質(zhì)在DNA 上留下的足跡,因而被形象地稱作足跡法. 如果同時進行DNA 化學(xué)測序, 即可判斷出結(jié)合區(qū)的精確順序。原核生物啟動子基本結(jié)構(gòu)：原核生物中經(jīng)對啟動子的比較，它們有共有序列：在上游10bp處為TATAAT，又稱為Pribnow盒在上游35bp處為TT

16、GACA，又稱為sextama盒典型原核啟動子的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶 主要接觸位點 -35區(qū)-10區(qū) TTGACA16-17bpTATAAT5-9bp轉(zhuǎn)錄起始位點 決定啟動子的強度 保守序列 AT含量多，有利于DNA雙鏈解鏈原核啟動子保守區(qū)的功能：1，sextama box(-35區(qū))：RNA聚合酶識別位點，該序列提供了RNA聚合酶識別的信號。 亞基識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板。這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動子的強度。2，Pribnow box（-10區(qū)）： RNA聚合酶牢固結(jié)合位點，此處AT含量多，有助于DNA局部雙鏈解開。是使起始復(fù)合物由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成啟動狀態(tài)的特定序列-10區(qū)序

17、列對轉(zhuǎn)錄的效率影響:TATAATAATAAT，轉(zhuǎn)錄效率下降,稱為下降突變（down mutation）。TATGTTTATATT，轉(zhuǎn)錄效率上升，為上升突變（up mutation）。由于堿基的改變可能導(dǎo)致DNA雙鏈的雙螺旋發(fā)生改變，最終導(dǎo)致酶與DNA結(jié)合所需要的自由能增加或者降低，從而使轉(zhuǎn)錄的效率上升或者下降四、轉(zhuǎn)錄的基本過程：1.啟動子的識別 2.轉(zhuǎn)錄起始 3.RNA鏈的延伸 4.終止啟動子識別、轉(zhuǎn)錄的起始：1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動。2. 起始識別：全酶與35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動子二元復(fù)合物。3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部

18、變性，形成開放的啟動子二元復(fù)合體；4. 酶移動到起點，第一和二個NTP相連，因子釋放,形成酶-啟動子-NTP三元復(fù)合物轉(zhuǎn)錄的延伸：延伸的過程中，RNA聚合酶沿著轉(zhuǎn)錄泡（DNA雙鏈解開而形成，約18堿基對）向前移動。轉(zhuǎn)錄泡：在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合。轉(zhuǎn)錄的終止：1不依賴于(rho)因子 的終止（強終止子）結(jié)構(gòu)特點：(1) 有富含GC的二重對稱區(qū)；(2)莖的區(qū)域富內(nèi)含G-C；(3) 強終止子3端上有poly(U) ，一般為6個強終止子終止轉(zhuǎn)錄的機制：（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變RNA聚合酶構(gòu)象，使酶停止移動

19、；（2）DNA、RNA各自形成自身雙鏈使雜交體不穩(wěn)定而分離；（3）3´端一連串U，UA配對最不穩(wěn)定，易從模板上脫落。2依賴于因子的終止結(jié)構(gòu)特點：(1)轉(zhuǎn)錄的RNA也具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但發(fā)夾結(jié)構(gòu)后無poly(U)；(2)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較疏松，莖環(huán)上不富含GC；(3)終止需要因子的參與；（4）與不依賴于因子的終止一樣，終止信號存在于新生的RNA鏈上而非DNA鏈上。五、真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點：（1） 原核只有一種RNA聚合酶，而真核細胞有三種聚合酶；（2）啟動子的結(jié)構(gòu)特點不同，真核有三種不同的啟動子和有關(guān)的元件；（3） 真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu)：-8

20、0-110區(qū) 75區(qū) -25區(qū) +1 GC box CAAT box TATA box 起始位點1核心啟動子：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)l錄起始位點及起始位點上游的TATA盒。核心啟動子單獨起作用時，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄起始位點： mRNA的第一個堿基傾向A TATA框： 其一致序列是T85A97T93A85A63A83A50，TATA框的作用：(1) 選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始，故也稱為選擇子。(2) 影響轉(zhuǎn)錄的速率。2真核生物的上游啟動子元件包括通常位于75 bp 附近的CAAT box（相當于原核啟動子的sextama

21、box）和GC box作用：控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，基本不參與起始位點的確定六、真核mRNA前體的加工真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工步驟：（1）加帽5端：m7GpppGpN帽子（甲基化的鳥苷酸）的類型：在末端鳥苷的第7位上存在單個甲基化位點的稱O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2-0H位點上還有一個甲基位點的稱1型帽子此外，在第三個核苷酸的核糖上（2-0H）有甲基化位點的稱2型帽子 這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結(jié)構(gòu) 帽子結(jié)構(gòu)的功能：(1)有助于mRNA越過核膜，進入胞質(zhì)；(2)保護5'不被酶降解；(3)翻譯時供IF（起始因子）和核糖體識別。（2）加尾3端：polyA尾巴過程：1.特殊組分(C

22、PSF)識別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性2.剪切因子(CF)在加尾位點 AAUAAA下游1130nt 處剪切RNA；3.末端腺苷轉(zhuǎn)移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；4.PBP（poly A結(jié)合蛋白）與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。尾巴的功能：1.PolyA是mRNA由核進入胞質(zhì)所必需的形式。2.PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 （3）mRNA前體的剪接剪除內(nèi)含子，連接外顯子選擇性剪接：基因的初始轉(zhuǎn)錄物通過不同的剪接方式而實現(xiàn)的外顯子的選擇性使用。選擇性剪接可以利用同一初級轉(zhuǎn)錄物得到不同的mRNA，翻譯成不同的蛋白質(zhì)。在人類基因中大約有的基因具有選擇性剪接的形式選擇性剪

23、接的意義：1，選擇性剪接極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達的復(fù)雜程度2，性別決定與發(fā)育：選擇性剪接可以調(diào)節(jié)決定性別及發(fā)育相關(guān)蛋白的表達3，許多疾病與mRNA前代選擇性剪接有關(guān)RNA編輯：是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變。形式：，單堿基突變，尿苷酸的缺失和添加原核生物和真核生物mRNA的不同比較類別原核生物真核生物轉(zhuǎn)錄發(fā)生的場所類核/擬核核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的形式多順反子，有操縱子單順反子，無操縱子轉(zhuǎn)錄所需要蛋白質(zhì)RNA聚合酶聚合酶加大量輔助因子轉(zhuǎn)錄后是否需要加工不需加工與翻譯相偶聯(lián)需加工故與翻譯相分離mRNA的壽命短較長第四章 生物信息的傳

24、遞（下）1，翻譯：以mRNA為模板，按照mRNA分子上的三個核苷酸決定一種氨基酸的規(guī)則（三聯(lián)體密碼）合成具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)。包括翻譯的起始、肽鏈的延伸、肽鏈的終止與釋放。2，核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）是模板與氨基酸之間的接合體。此外，在合成的各個階段還有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。實驗證實三聯(lián)子密碼（遺傳學(xué)證據(jù)）：1、mRNA模板中插入、刪除一個核苷酸后，該密碼子后面的氨基酸序列全部改變。2、同時插入、刪除一個不同核苷酸后，后續(xù)蛋白質(zhì)不變。3、同時刪除三個核苷酸后，翻譯減少一個氨基酸，序列沒有變化。 煙草花葉病毒外殼蛋白亞基由4

25、00個氨基酸組成，而相應(yīng)的RNA片段長約1200個核苷酸實驗破譯三聯(lián)子密碼：一，以均聚物、隨機共聚物和特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成二，核糖體結(jié)合技術(shù)/三聯(lián)體結(jié)合實驗原理及實驗操作： 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等為模板，在含核糖體、AA-tRNA的適當離子強度的反應(yīng)液中保溫，然后使反應(yīng)液通過硝酸纖維素濾膜。游離的AA-tRNA因相對分子質(zhì)量小能自由通過濾膜，加入三核苷酸模板可以促使其對應(yīng)的AA-tRNA結(jié)合到核糖體上，體積超過膜上的微孔而被滯留，這樣就能把已結(jié)合到核糖體上的AA-tRNA與未結(jié)合的AA-tRNA分開。（一）遺傳密碼的性質(zhì)一、遺傳密碼的簡并性：1 簡并：個

26、氨基酸有多個密碼子的現(xiàn)象或多個密碼子為1個氨基酸編碼。 2編碼同一種氨基酸的密碼子稱同義密碼子 3 簡并性減少變異對生物的影響二、密碼子的普遍性與特殊性：遺傳密碼無論在體內(nèi)還是體外，也無論是對病毒、細菌、動物還是植物而言都是適用的，所以，密碼子具有普遍性。已經(jīng)查明，在支原體中，終止密碼子UGA被用來編碼色氨酸；在嗜熱四膜蟲中，另一個終止密碼子UAA被用來編碼谷氨酰胺。密碼子具有特殊性。三、密碼子的變偶性： 即在密碼子與反密碼子配對時，前面兩對堿基嚴格按堿基配對原則，而第三時堿基允許有一定的自由度擺動假說，變偶假說。 密碼子的第三位堿基比前三個堿基具有較小的專一性。四、密碼子無標點、不重疊（二）

27、tRNA(第二遺傳密碼)tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，它不但為每個三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了運送載體。1 tRNA的三葉草型二級結(jié)構(gòu)：五臂四環(huán)tRNA的三級結(jié)構(gòu)：L型2 tRNA的功能：識別mRNA鏈上的密碼子；轉(zhuǎn)移氨基酸作用3 tRNA的分類：（1）起始tRNA和延伸tRNA：能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA：代表同一種氨基酸的tRNA稱為同工tRNA，同工t

28、RNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被AA- tRNA合成酶識別。（3）校正tRNA：分為無義突變及錯義突變校正tRNA 。無義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA），使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯義突變：是由于結(jié)構(gòu)基因中某個核苷酸的變化使一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼。錯義突變的校正tRNA通過反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質(zhì)。校正tRNA在進行校正過程中必須與正常的tRNA競爭結(jié)合密碼子。無

29、義突變的校正tRNA必須與釋放因子競爭識別密碼子；錯義突變的校正tRNA必須與該密碼的正常tRNA競爭，都會影響校正的效率。（三）核糖體核糖核蛋白的結(jié)構(gòu)：1 由大小二亞基組成 2 給位（P位，肽位）： 起始時， tRNAimet結(jié)合于核糖體的肽位延長成肽后，肽鏈轉(zhuǎn)到此位。3 受位（A位，氨基酰位）：延長成肽時，氨基酰tRNA就加入此位。核糖核蛋白的種類(胞質(zhì)中)4 游離的核糖核蛋白-合成細胞固有蛋白 5 與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖核蛋白-合成帶有信號肽的分泌性蛋白質(zhì)原核與真核生物中核糖體的組成分別怎樣？原核生物核糖體：由2/3的RNA及1/3蛋白質(zhì)組成，核糖體的大小為70S，可分為30S小亞基和5

30、0S大亞基。真核生物核糖體：由3/5的RNA及2/5蛋白質(zhì)組成，核糖體的大小為80S，可分為40S小亞基和60S大亞基。（四）蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機制1 氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運酶tRNA合成酶絕對專一性 1個A.A1個氨基酰tRNA合成酶催化反應(yīng)活化A.A-活化“-COOH”消耗2個ATP活化A.A+tRNA 氨基酰tRNA2 肽鏈合成的起始原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet，而真核生物是Met-tRNAiMet。原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，

31、再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物。起始復(fù)合物的生成除了需要GTP提供能量外，還需要Mg2+、NH4+及3個起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。 真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始機制與原核生物基本相同，其差異主要是核糖體較大，有較多的起始因子參與，其mRNA具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，Met-tRNAMet不甲?；?，mRNA分子5' 端的“帽子”和3' 端的多聚A都參與形成翻譯起始復(fù)合物。3 肽鏈的延伸生成起始復(fù)合物，第一個氨基酸（fMet/Met-tRNA）與核糖體結(jié)合以后，肽鏈開始伸長。

32、按照mRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個氨基酸就是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位、無負載的tRNA 的脫落。 肽鏈延伸的具體過程：1）后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合（進位）、2）肽鍵的生成(轉(zhuǎn)肽)、3）移位、4）脫落4 肽鏈的終止  肽鏈的延伸過程中，當終止密碼子UAA、UAG或UGA出現(xiàn)在核糖體的A位時，沒有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識別這些密碼子并與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵。接著，新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體大、小亞基解體，蛋白

33、質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽鏈與核糖體解離。     細菌細胞內(nèi)存在三種不同的終止因子（或稱釋放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能識別UAG和UAA，RF2識別UGA和UAA。一旦RF與終止密碼相結(jié)合，它們就能誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)移酶把一個水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽鏈上。RF3可能與核糖體的解體有關(guān)。真核細胞只有一個（RF）終止因子。 (五)蛋白質(zhì)前體的加工新生的多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必須經(jīng)過加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。 1N端fMet或Met的切除2二硫鍵的形成3特定氨基酸的修飾4切除新生肽鏈中非功能片段蛋白質(zhì)合成

34、抑制劑：    蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、環(huán)已亞胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖體滅活蛋白等都能抑制蛋白質(zhì)的合成。1 鏈霉素是一種堿性三糖，能干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，也會導(dǎo)致mRNA的錯讀。 2 嘌呤霉素是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上，抑制AA-tRNA的進入，嘌呤霉素是通過提前釋放肽鏈來抑制蛋白質(zhì)合成的 蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)機制：一般說來，蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)可分為兩大類：翻譯運轉(zhuǎn)同步機制:蛋白質(zhì)的合成和運轉(zhuǎn)同時發(fā)生的翻譯后運轉(zhuǎn)機制：

35、蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運轉(zhuǎn)。 第5-6章分子生物學(xué)的研究法（一）限制性核酸內(nèi)切酶: 是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。（只催化非甲基化的DNA的水解，不兼有甲基化酶的活性，修飾由其他酵素進行）1.限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型三類。其中型較重要，主要特征是主要特征型限制修飾單功能（專一）蛋白結(jié)構(gòu)同源三聚體（單一的亞基）輔助因子反應(yīng)需要Mg2+識別序列48bp回文序列切割為點識別序列內(nèi)或附近特異切割。功能：型限制性核酸內(nèi)切酶有嚴格的識別、切割順序，識別序列一般為48個

36、堿基對，具有迴文結(jié)構(gòu)。它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口（5粘性末端、3粘性末端和平頭末端）。2.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)操作大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100L Temperature Time 1-1.5h1個單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使用的緩沖液及溫度下，在50L反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1g標準DNA完全消化所需的酶

37、量。3.限制性核酸內(nèi)切酶的星活性：指由于反應(yīng)條件改變，酶切的核酸序列不同于它特定的識別序列,即酶切反應(yīng)的特異性發(fā)生了改變。星活性產(chǎn)生的原因如下：反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。 酶用量過大，大于100U/微克DNA。 低離子強度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有機劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價離子的存在。 常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 （二）DNA分子的連接DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸根和3-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應(yīng)需要能量。大腸

38、桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。粘性末端：用DNA連接酶連接 平頭末端：用T4-DNA連接酶連接（三）細菌轉(zhuǎn)化：是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導(dǎo)致遺傳性狀特征發(fā)生改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。步驟：1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。2.外源DNA粘附在細胞表面,形成復(fù)合物。3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會被

39、細胞所吸收。4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復(fù)5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。（四）核酸的凝膠電泳1.基本原理：一種帶電分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度、電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)、分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)系。 在一般情況下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子，把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。2.凝膠電泳方法及其分辨力：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范

40、圍為0.250kb之間 （瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物）。 聚丙烯酰胺凝膠電泳其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 （五）PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))及其應(yīng)用 概念：在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定DNA序列進行的體外擴增反應(yīng)。由多個循環(huán)組成。每個循環(huán)包括了變性（95oC 20-30秒）、退火（溫度由引物長度和GC含量決定）以及延伸（70-75oC）三個階段。能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴

41、增至十萬乃至百萬倍。標準的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR中應(yīng)注意的事項（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照：陽性對照： 陽性模板陰性對照： 陰性模板試劑對照： 除模板外的所有組分（六）基因克隆技術(shù)基因克隆：通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體,并導(dǎo)入受體細胞，進行永久保存和復(fù)制的過程。具體流程：（一）目的基因的獲?。ǘ┛寺≥d體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（四）重組DNA導(dǎo)入受

42、體菌（五）重組體的篩選基因克隆技術(shù)具體過程（1）目的基因的獲取方法 1. 化學(xué)合成法（要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列，由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列） 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library)：存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。 3. cDNA文庫(cDNA library)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。 將帶poly(A)的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接 制備用于克隆cDNA的mRNA cDN

43、A 的合成和克隆()cDNA 第一鏈的合成: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。 自身引導(dǎo)合成法 (）雙鏈 cDNA 的合成(第二條鏈的合成)： 置換合成法 自身引導(dǎo)合成法 ：單鏈cDNA的3端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow的作用下，合成cDNA的第二鏈。 缺點：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。 S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。置換合成法：以RNA酶H在第一鏈

44、合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二鏈。 優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化 c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA （）雙鏈cDNA分子與載體進行連接：將合成的雙鏈重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細胞增殖。 RACE技術(shù)獲取全長cDNA序列。（RACE技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends）是一項在已知cDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5端或3端缺失序列的技術(shù)。） （）基因文庫的篩選：通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含

45、有所需重組DNA分子的特定克隆過程。（如核酸雜交法、PCR篩選法、免疫篩選法）P176 4. 分離克隆差別表達的基因：根據(jù)表達特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因，以其組成型表達模式維持細胞的基本代謝活動；另一類叫做發(fā)育調(diào)控基因，以其時空特異性表達模式完成個體的正常生長、發(fā)育與分化，我們將不同基因在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的按時間、空間進行有序表達的方式稱為基因的差別表達。操作:(a）從不同發(fā)育階段或不同類型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA； （b）用5'隨機引物和某個3'

46、端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32P-dNTP)； (c) DNA變性測序膠分離擴增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測差別條帶；(d）回收特異性差別條帶；(e）用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；(f）用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；(g）以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA。（2）克隆載體的選擇和構(gòu)建1.載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力為外源基因的擴增提供必要的條件 2.載體特點 1) 至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2) 至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3) 至少應(yīng)有一個遺傳標記基因，以指示載體

47、或重組DNA分子是否進入宿主細胞 3.載體類型l 質(zhì)粒載體l 噬菌體載體l cosmid克隆載體l 噬菌粒載體l 酵母人工染色體載體l 細菌人工染色體載體分子克隆載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞的DNA分子（3）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接、(2)不同限制酶切位點連接2. 平端連接：適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端、粘端補齊或切平形成的平端3. 同聚物加尾連接： 在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，

48、就會彼此連接起來。4. 人工接頭(linker)連接：由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。 （4）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(competent) （5）重組體的篩選 標記基因篩選法 (利用標記基因指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞) 根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法1）PCR法 2）限制性核酸內(nèi)切酶酶切法 3）DNA測序法 (六) 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是功能的基礎(chǔ)。酵母雜交就是研究相互作用的方法?；驹恚航湍鸽p雜交系統(tǒng)巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)

49、構(gòu)（modular）特征，酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域BD 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。只有當他們在空間上接近時才能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。將編碼待測蛋白的基因分別與編碼BD及編碼AD基因構(gòu)成融合基因，并導(dǎo)入酵母細胞中。如果待測蛋白間存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子GAL4發(fā)揮作用，促使報告基因表達；如果待測蛋白間不存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子GAL4不能發(fā)揮作用，報告基因不表達。 用途：1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興

50、趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。（八）核酸雜交技術(shù) 1.Southern Blot 原理：將待檢測的DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小

51、。用途：檢測DNA樣品中的基因及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。 操作步驟：DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色2.Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。用途：檢測RNA樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 操作過程：mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光（九）RNA 干擾 RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。 RNA

52、i可以作為一種簡單、有效的基因沉默工具，因而在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面的應(yīng)用得到飛速發(fā)展。 原理： RNAi具有特異性和高效性。是一個依賴ATP的過程，一種稱為Dicer的核酸酶負責(zé)將dsRNA酶切轉(zhuǎn)化為3端有23nt突出、長2123bp 的小分子雙鏈RNA ，這種RNA稱為小干擾RNA（siRNA）。siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(RISC)，此復(fù)合物通過堿基互補配對識別靶mRNA 并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默。（十）基因組：1.基因組：生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總和。真核生物基因組：核基因組、線粒體基因組、葉綠體基因組原

53、核生物基因組：染色體、質(zhì)粒2. 基因組作圖：簡單來說，就是把一些分子標記在基因組上的位置標記出來。分子標記是具有特征性的DNA序列。（1）遺傳圖與物理圖 ：遺傳作圖：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它DNA順序標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析等。物理作圖：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組實際位置。（2）常用的物理作圖方法： 由于遺傳圖的局限，須用物理圖對其進行驗證，校正和補充。l 限制性作圖（將限制酶的酶切位點標定在DNA分子的相對位置） l 熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作圖l 順序標簽位點（Sequence tagged site, STS）作圖 序列標記位點（STS）作圖· 目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大基因組作