大腸埃希菌的檢測(cè)

1、檢測(cè)意義大腸埃希菌是腸道中存在的正常菌群，故常來(lái)源于人和動(dòng)物的糞便，所以常作為糞便污染的指標(biāo)。一旦被檢藥物中查出大腸埃希菌，表明該藥品已被糞便污染，可能存在腸道致病菌和寄生蟲(chóng)卵，患者服用該藥物后有引起感染的危險(xiǎn)。因此，大腸埃希菌被列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。國(guó)家藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定口服藥品不得檢出大腸埃希菌。中國(guó)藥典采用了MUGIndole快速測(cè)定藥品中大腸埃希菌。在MUG試驗(yàn)中，將MUG（4-甲基傘形酮葡糖苷酸）作為目標(biāo)菌的基本營(yíng)養(yǎng)物加入培養(yǎng)基中，被大腸埃希菌的-葡萄糖醛酸酶直接分解產(chǎn)物又作為一種指示系統(tǒng)，在366 nm紫外光下呈現(xiàn)蘭白色熒光，即MUG陽(yáng)性；若無(wú)熒光，即MUG陰性。靛基質(zhì)（Indole

2、）試驗(yàn)中，大腸埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 因此根據(jù)大腸埃希菌的這一性質(zhì)，對(duì)MUG呈陽(yáng)性者，再加對(duì)-甲氨基苯甲醛試劑數(shù)滴，輕搖試管，培養(yǎng)液上層呈現(xiàn)玫瑰紅色者(陽(yáng)性)，報(bào)告檢出大腸埃希菌。如果兩者都為陰性，報(bào)告未檢出大腸埃希菌。如果一陰一陽(yáng)，需要進(jìn)一步的培養(yǎng)和生化試驗(yàn)檢查。本方法對(duì)大腸埃希菌的檢出率達(dá)98。培養(yǎng)溫度：控制菌培養(yǎng)溫度為3035。蒸汽滅菌物品：蒸汽滅菌物品：1.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管10支干熱滅菌干熱滅菌物體：物體：5mL移液管1支1mL移液管5支胨10.0g 硫酸錳0.5mg硫酸鋅0

3、.5mg 硫酸鎂0.1g氯化鈉5.0g 氯化鈣50.0mg 磷酸二氫鉀0.9g 磷酸氫二鈉6.2g亞硫酸鈉40.0mg 去氧膽酸鈉1.0g MUG 75mg 水1000mL 除MUG外，取上述成分，混合。微溫溶解，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每管分裝5mL，滅菌。取供試供試液1mL，直接或處理后接種在制好的100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,在37恒溫箱中培養(yǎng)1824 h，進(jìn)行增菌培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物0.2mL,接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5小時(shí)，24小時(shí)在366nm紫外燈光下觀(guān)察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基做本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性，不呈現(xiàn)熒光，則為M

4、UG陰性。觀(guān)察后，沿著培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，葉面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性，呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊紅水溶液2ml，0.5%美藍(lán)水溶液1ml，將已滅菌的蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基（pH7.6）加熱溶化，冷卻至60左右時(shí)，再把已滅菌的乳糖溶液，伊紅水溶液及美藍(lán)溶液按上述量以無(wú)菌操作加入。搖勻后，立即倒平板。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴(yán)格控制滅菌

5、溫度，115滅菌20min。1.MUG1.MUG、靛基質(zhì)結(jié)果判斷、靛基質(zhì)結(jié)果判斷MUG培養(yǎng)結(jié)果：在366nm紫外線(xiàn)下觀(guān)察靛基質(zhì)結(jié)果：液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試液本色，為靛基質(zhì)陰性MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判檢出大腸桿菌； MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌；MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，需進(jìn)一步做以下檢查2 2。EMBEMB培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)結(jié)果判斷EMB培養(yǎng)18-24h后，檢查有無(wú)疑似大腸埃希菌菌落（大腸埃希菌落形態(tài)特征見(jiàn)表），若無(wú)，判供試品未檢出大腸埃希菌；若有，進(jìn)一步做以下試驗(yàn)大腸埃希菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基培養(yǎng)基菌落形態(tài)菌落形態(tài)EMBEMB呈紫黑色、淺紫色、籃紫色或粉紅呈紫黑色、淺紫色、籃紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心，圓形，微突起，邊緣整齊，表中心，圓形，微突起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤金屬光澤。檢驗(yàn)依據(jù)： 2010年版中國(guó)藥典二部附錄J 微生物限度檢查法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：口服制劑細(xì)菌數(shù)1g不得超過(guò)1000個(gè)；1ml不得超過(guò)100個(gè)。霉菌及酵母菌數(shù)1g不得超過(guò)100個(gè)。控制菌1g（1ml）不得檢出大腸埃希菌。1實(shí)訓(xùn)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。2供試液稀釋及注入培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)搖勻再取，供試液從制備至加入培養(yǎng)基不得超過(guò)1h.3配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必調(diào)pH，否則pH偏高，MUG分解，本