實驗6+DNA酶切、連接及電泳檢測

1、 質(zhì)粒在正常情況下以共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒在正常情況下以共價閉合環(huán)狀cccDNA構(gòu)型構(gòu)型(超螺旋超螺旋scDNA)存在存在，在提取過程中由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會使，在提取過程中由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會使DNA鏈發(fā)鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價閉合環(huán)狀生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價閉合環(huán)狀/超超螺旋螺旋DNA(cccDNA)；開環(huán)；開環(huán)DNA(ocDNA）；線形）；線形DNA(LDNA)質(zhì)粒質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖瓊脂糖凝膠電泳模式圖M pUC19環(huán)形質(zhì)粒環(huán)形質(zhì)粒DNA超螺旋粒超螺旋粒DNA實驗六實驗六DNADN

2、A的酶切、連接及電泳檢測的酶切、連接及電泳檢測實實 驗驗 步步 驟驟（一）質(zhì)粒（一）質(zhì)粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注：每人一管）在在200l 200l 的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：ll）混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底?；靹颍稽c動離心將反應(yīng)液甩至管底。37(PCR37(PCR儀儀) )保溫保溫1-2h1-2h進行酶切反應(yīng)。進行酶切反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)結(jié)束后， 75 75，保溫，保溫10min10min使酶失活。使酶失活。電泳檢測電泳檢測 酶切酶切（二）（二） DNA DNA片段的連接片段的連接( (注：每人一管）注：每人一管）取

3、取200 l200 l的離心管按下表加入試劑。的離心管按下表加入試劑。混勻后點動離心，將溶液甩至管底混勻后點動離心，將溶液甩至管底置于已調(diào)好溫度為置于已調(diào)好溫度為12-16PCR12-16PCR儀中儀中保溫保溫1-2h1-2h后取出后取出電泳檢測電泳檢測 連接連接（三）質(zhì)粒酶切樣品和（三）質(zhì)粒酶切樣品和DNADNA連接樣品的電泳檢測連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備瓊脂糖凝膠的制備：制備2 2塊塊0.7% 0.7% （0.28g/40ml0.28g/40ml）和）和2 2塊塊1.2%1.2%瓊脂糖瓊脂糖凝膠（凝膠（0.48g/40ml0.48g/40ml）。）。 （注：全班制備（注：全班

4、制備4 4塊膠）塊膠）1、掌握限制性內(nèi)切酶的特性及酶切體系的建立；、掌握限制性內(nèi)切酶的特性及酶切體系的建立；2、了解影響酶切的因素；、了解影響酶切的因素；3、掌握、掌握DNA連接酶的性質(zhì)以及連接體系的建立；連接酶的性質(zhì)以及連接體系的建立；4、了解影響連接反應(yīng)的因素。、了解影響連接反應(yīng)的因素。實實 驗驗 目目 的的通過通過DNADNA重組技術(shù)構(gòu)建重組技術(shù)構(gòu)建DNADNA重組子重組子 利用利用限制性核酸內(nèi)切酶切割限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA+利用利用DNA連接酶連連接酶連接接DNA是是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。 成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進入宿主成功的酶切

5、和有效的連接為后續(xù)的外源基因進入宿主細胞進行表達提供了有效的實驗材料。細胞進行表達提供了有效的實驗材料。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1965年年Werner Arber第一個第一個描述了限制性內(nèi)切現(xiàn)象描述了限制性內(nèi)切現(xiàn)象；Hamilton O. Smith第一個第一個純化了限制性內(nèi)切酶純化了限制性內(nèi)切酶，并鑒定了，并鑒定了其性質(zhì)；其性質(zhì)；Daniel Nathans用這些酶將用這些酶將SV40病毒的病毒的DNA切割成了特定切割成了特定的片段，并繪制了的片段，并繪制了SV40病毒基因組的病毒基因組的“物理圖譜物理圖譜”。1978年這三人獲得了當年的年這三人獲得了當年的Nobel獎。獎。A

6、rber W. Smith H.O. Nathans D. 第一個第一個DNA重組分子重組分子1972年年P(guān)aul Berg等人利用限制性內(nèi)切酶等人利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和和連接酶獲得了第一個連接酶獲得了第一個DNA重組分子。標志著遺傳工重組分子。標志著遺傳工程的開始。程的開始。The Nobel Prize in Chemistry 1980 Paul Berg 通過通過DNADNA重組技術(shù)構(gòu)建重組技術(shù)構(gòu)建DNADNA重組子重組子酶切酶切連接連接實實 驗驗 原原 理理 酶切酶切 限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）:一種在特一種在特殊核甘酸序列處

7、殊核甘酸序列處水解雙鏈水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。的內(nèi)切酶。 限制性內(nèi)切酶能限制性內(nèi)切酶能特異性地結(jié)合特異性地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識于一段被稱為限制性酶識別序列的別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點上，并切序列之內(nèi)或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈割雙鏈DNA。 l 生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種序列的一種內(nèi)切核內(nèi)切核酸酶酸酶。它是可以將。它是可以將外來的外來的DNA切斷切斷的酶，即能夠限制異源的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對的侵入并使之失去活力，但對自己的自己的DNA卻無損害卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。

8、由于這種切割作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶。 根據(jù)限制酶的識根據(jù)限制酶的識別切割特性別切割特性、催化催化條件條件及及是否有修飾酶活性是否有修飾酶活性，可分為，可分為型、型、 型和型和型三類。型三類。DNA重重組技術(shù)中組技術(shù)中最常用的是最常用的是型酶型酶，切割，切割后得到的是后得到的是帶粘性末端帶粘性末端或平或平末端的末端的線性線性DNA。 型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而的水解；而型限制性內(nèi)切酶型

9、限制性內(nèi)切酶只催只催化非甲基化的化非甲基化的DNA的水解。的水解。 型型切割位點則在下游切割位點則在下游 24-26bp 處處 。命名命名l 一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株個字母組成，第四個字母表示菌株(品系品系)。例如。例如，從，從Bacillus amylolique faciens H中提取的限中提取的限制性內(nèi)切酶稱為制性內(nèi)切酶稱為Bam H，在同一品系細菌中得到，在同一品系細菌中得到的識別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可的識別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如以編成不同的號，如H

10、indII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。等。 II型限制性內(nèi)切酶主要特點：型限制性內(nèi)切酶主要特點：識別的專一核苷酸順序最常見的是識別的專一核苷酸順序最常見的是4個個或或6個核苷酸，少數(shù)也有識別個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸個核苷酸以及以及7個、個、8個、個、9個、個、10個和個和11個核苷個核苷酸的。在分子克隆實驗中使用最普遍的酸的。在分子克隆實驗中使用最普遍的是那些識別是那些識別4個或個或6個堿基對的限制性內(nèi)個堿基對的限制性內(nèi)切酶。切酶。II 型限制性內(nèi)切酶的識別順序是型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱一個回文對稱順序，即有一個中

11、心對稱軸，從這個軸朝兩個方向軸，從這個軸朝兩個方向“讀讀”都完全都完全相同。相同。這種酶的切割可以有兩種方式：這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端和平頭末端。粘性末端和平頭末端。如如: EcoRI的識別順序為：的識別順序為： 5 G A A T T C 3 3.C T T A A G 5回文結(jié)構(gòu)的對稱軸回文結(jié)構(gòu)的對稱軸 限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，1 1個酶單位個酶單位（1 Unit1 Unit）指的是在指定緩沖液中，指的是在指定緩沖液中，3737下反應(yīng)下反應(yīng)60min,60min,完完全酶切全酶切1g1g的純的純DNADNA所用的酶量。所用的酶

12、量。 影響酶切的因素：影響酶切的因素：在酶切反應(yīng)中，在酶切反應(yīng)中，DNADNA的純度、緩沖液的純度、緩沖液中的離子強度、中的離子強度、Mg2+Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長反應(yīng)時間等措施以達到加酶的用量，延長反應(yīng)時間等措施以達到完全酶切完全酶切。但應(yīng)。但應(yīng)該注意的是，過多的酶量和過長的反應(yīng)時間會造成非特異該注意的是，過多的酶量和過長的反應(yīng)時間會造成非特異性的酶切性的酶切( (星號活性星號活性) )。圖圖: :構(gòu)建構(gòu)建DNADNA重組子重組子材料、試劑及器具材料、試劑及器具1 1、材料與試劑、材料與試劑酶切反應(yīng)：酶切反應(yīng)：p標準標準pUC

13、19(2686bp) pUC19(2686bp) pEcoREcoR及其配套的酶切緩沖液及其配套的酶切緩沖液 檢測：檢測：p0.50.5TBETBE電泳緩沖液電泳緩沖液p6 6電泳載樣緩沖液電泳載樣緩沖液 、GoldviewGoldview、瓊脂糖、瓊脂糖2 2 、器具：、器具：p水平式電泳裝置水平式電泳裝置p電泳儀電泳儀, ,臺式高速離心機臺式高速離心機p恒溫水浴鍋（用恒溫水浴鍋（用PCRPCR儀代理）儀代理）p微量移液槍微量移液槍p微波爐或電爐微波爐或電爐p紫外透射儀紫外透射儀p照相機及其附件照相機及其附件實實 驗驗 步步 驟驟（一）質(zhì)粒（一）質(zhì)粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注

14、：每人一管）在在200l 200l 的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：的薄壁離心管中，按照下表加入試劑（單位：ll）混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底。混勻；點動離心將反應(yīng)液甩至管底。37(PCR37(PCR儀儀) )保溫保溫1-2h1-2h進行酶切反應(yīng)。進行酶切反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)結(jié)束后， 75 75，保溫，保溫10min10min使酶失活。使酶失活。電泳檢測電泳檢測 （三）質(zhì)粒酶切樣品、（三）質(zhì)粒酶切樣品、DNADNA連接樣品的電泳檢測連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備瓊脂糖凝膠的制備：制備2 2塊塊0.7% 0.7% （0.28g/40ml)0.28g/40ml)（四）加樣及電

15、泳檢測（四）加樣及電泳檢測1 1、酶切樣品的檢測、酶切樣品的檢測p酶切陰性對照（酶切陰性對照（M1M1）：）：pUC19pUC19標樣標樣 20l + 20l + 6X6X的的loading buffer loading buffer 4 4llp酶切樣品：酶切樣品：pUC19pUC19酶切樣品酶切樣品 20l+ 20l+ 6X6X的的loading buffer loading buffer 3 3ll(1) DNADNA連接酶連接酶是是19671967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種。它是一種封閉封閉DNADNA鏈上缺口酶鏈上缺口酶，借助，借助ATPATP或或NA

16、DNAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNADNA鏈的鏈的5-PO45-PO4與另一與另一DNADNA鏈的鏈的3-OH3-OH生成生成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA(T4DNA連接酶連接酶除外除外) )，而且必須是兩條緊鄰，而且必須是兩條緊鄰DNADNA鏈才能被鏈才能被DNADNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。連接酶催化成磷酸二酯鍵。 常用的常用的DNADNA連接酶有兩種：來自大腸桿菌的連接酶有兩種：來自大腸桿菌的DNADNA連接酶連接酶和來自和來自噬菌體的噬菌體的T4DNAT4DNA連接酶連接酶。二者的。二

17、者的作用機理類似。作用機理類似。實實 驗驗 原原 理理 連接連接核酸片段可以通過核酸片段可以通過連接酶連接酶的作用的作用連接起來而獲得連接起來而獲得重組分子重組分子。DNA連接酶催化雙鏈連接酶催化雙鏈DNA分子中分子中相鄰堿基的相鄰堿基的5- PO4末端與末端與3-OH間形成間形成3,5-磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。一個一個DNA片段的片段的5-PO4末端與另末端與另一個一個3-OH末端相互靠近時，末端相互靠近時，在在DNA連接酶的作用下，有連接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的緩沖系統(tǒng)中存在的緩沖系統(tǒng)中可以被連接起來而形成重組分可以被連接起來而形成重組分子。子。DNADNA連接酶作用機制連接酶

18、作用機制實實 驗驗 原原 理理 連接連接酶酶焦磷酸根焦磷酸根酶酶-焦磷酸根焦磷酸根酶酶l T4 DNA連接酶作用機制：連接酶作用機制：T4 DNA連接酶作用分三步：連接酶作用分三步：(1) T4 DNA連接酶與輔助因子連接酶與輔助因子ATP形成形成酶酶AMP復復合物合物。(2) 酶酶AMP復合物結(jié)合到具有復合物結(jié)合到具有5磷酸基和磷酸基和3羥羥基切口的基切口的DNA上，使上，使DNA腺苷化腺苷化。(3) 產(chǎn)生一個產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來，把缺口封起來.常用的常用的DNADNA連接酶是連接酶是T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶，其作用底，其作用底物是雙鏈的物是雙鏈的D

19、NADNA分子或分子或RNARNA：DNADNA雜交分子，雜交分子，可以連接粘性末端、平末端?？梢赃B接粘性末端、平末端。T4 DNAT4 DNA連接酶的活性用連接酶的活性用WeissWeiss單位表示。單位表示。1 Weiss1 Weiss單位是指在單位是指在3737下下20min20min內(nèi)催化內(nèi)催化1nmol 1nmol 3232P P從焦磷酸根置換到從焦磷酸根置換到 ,- ,-3232P ATPP ATP所所需的酶量。需的酶量。l T T4 4DNADNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為連接酶的最適反應(yīng)溫度為，為什么實，為什么實驗中采用驗中采用1414？1.1.粘性末端形成的氫鍵在低溫下更穩(wěn)定；粘

20、性末端形成的氫鍵在低溫下更穩(wěn)定；2. 2. 連接反應(yīng)時間長，低溫下酶不容易失活連接反應(yīng)時間長，低溫下酶不容易失活材料、試劑及器具材料、試劑及器具1 1、材料與試劑、材料與試劑連接反應(yīng)：連接反應(yīng)：pDNA/EcoT14 I : :由由1111條條DNADNA片段組成：片段組成：1932919329、77437743、6223bp6223bp、42544254、34723472、 2690 2690、18821882、14891489、925925、421421、74 bp74 bppT4 DNAT4 DNA連接酶及其配套的連接酶及其配套的 10 10連接緩沖液連接緩沖液檢測：檢測：p0.50.5

21、TBETBE電泳緩沖液電泳緩沖液p6 6電泳載樣緩沖液電泳載樣緩沖液 、GoldviewGoldview、瓊脂糖、瓊脂糖2 2 、器具：、器具：p水平式電泳裝置水平式電泳裝置p電泳儀電泳儀, ,臺式高速離心機臺式高速離心機p恒溫水浴鍋（用恒溫水浴鍋（用PCRPCR儀代理）儀代理）p微量移液槍微量移液槍p微波爐或電爐微波爐或電爐p紫外透射儀紫外透射儀p照相機及其附件照相機及其附件（一）（一）DNADNA片段的連接片段的連接( (注：每人一管）注：每人一管）取取200 l200 l的離心管按下表加入試劑。的離心管按下表加入試劑?；靹蚝簏c動離心，將溶液甩至管底混勻后點動離心，將溶液甩至管底置于已調(diào)好

22、溫度為置于已調(diào)好溫度為12-14PCR12-14PCR儀中儀中保溫保溫1-2h1-2h后取出后取出電泳檢測電泳檢測實實 驗驗 步步 驟驟（二）（二）DNADNA連接樣品的電泳檢測連接樣品的電泳檢測瓊脂糖凝膠的制備：制備瓊脂糖凝膠的制備：制備2 2塊塊1.2%1.2%瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（0.48g/40ml0.48g/40ml）。）。（三）加樣及電泳檢測（三）加樣及電泳檢測連接樣品檢測：連接樣品檢測：p/EcoT14 I /EcoT14 I 樣品樣品 5l 5l（M2M2）pDNADNA連接樣品：連接樣品：20 l l 恒壓電泳恒壓電泳: 130V : 130V 電泳至溴酚藍離凝膠外端電泳至

23、溴酚藍離凝膠外端1-2cm1-2cm處，大約處，大約30-4030-40分鐘分鐘觀察觀察: :紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果，并拍照記錄。紫外透射儀下觀察電泳結(jié)果，并拍照記錄。實驗預(yù)期結(jié)果實驗預(yù)期結(jié)果質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果從左至右：從左至右：1. /EcoT14 I DNA Marker2. pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒3. pUC19質(zhì)粒酶切樣品質(zhì)粒酶切樣品 1 2 3質(zhì)粒不同構(gòu)型的電泳行為質(zhì)粒不同構(gòu)型的電泳行為線型線型DNA超螺旋超螺旋DNA1 2 3 4 5 6 1：-EcoT14 digest2,3：連接產(chǎn)物：連接產(chǎn)物4：pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒5,6：酶切產(chǎn)物：酶切產(chǎn)物DNA片段的連接樣品電泳預(yù)期結(jié)果片段的連接樣品電泳預(yù)期結(jié)果 1： DNA/Eco14酶切片段酶切片段2-3：DNA/Eco14 酶切片段酶切片段的連接的連接 產(chǎn)物產(chǎn)物 l 1、連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分：、連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含