第七章雙水相

1、第七章第七章 雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù) 溶液的分相不一定完全依賴于有機(jī)溶劑，溶液的分相不一定完全依賴于有機(jī)溶劑，在一定條件在一定條件下，水相也可以形成兩相下，水相也可以形成兩相( (即雙水相系統(tǒng)即雙水相系統(tǒng)) )甚至多相。于是有甚至多相。于是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。有機(jī)溶劑萃取的不足：有機(jī)溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)許多蛋白質(zhì)都有都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑 ；蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變

2、性失活。聚合物的不相溶性：聚合物的不相溶性：u 主要是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲主要是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲 透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時，就不能形成單一的透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時，就不能形成單一的 水相，所以具有強(qiáng)烈的相分離傾向。水相，所以具有強(qiáng)烈的相分離傾向。u 某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液相混合時，只要濃某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液相混合時，只要濃 度達(dá)到一定值，也會形成兩相，即聚合物度達(dá)到一定值，也會形成兩相，即聚合物鹽雙水相體系鹽雙水相體系 系統(tǒng)含水量多達(dá)系統(tǒng)含水量多達(dá)75 %75 %90 % ,90 % ,兩相界面張力極低兩相

3、界面張力極低, ,有助于有助于保持生物活性和強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞保持生物活性和強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞 分相時間短分相時間短( (特別是聚合物特別是聚合物/ / 鹽系統(tǒng)鹽系統(tǒng)) ,) ,自然分相時間一般自然分相時間一般只有只有5 515min15min。 雙水相萃取技術(shù)易于連續(xù)化操作。雙水相萃取技術(shù)易于連續(xù)化操作。 目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于3 ,3 ,大多數(shù)情況下大多數(shù)情況下, ,目標(biāo)產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)物有較高的收率。有較高的收率。( P141 )( P141 ) 大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉, ,與其它常用固液與其它常用固液分離方法相比

4、分離方法相比, ,雙水相萃取技術(shù)可省去雙水相萃取技術(shù)可省去1 12 2 個分離步驟個分離步驟, ,使使整個分離過程更經(jīng)濟(jì)。整個分離過程更經(jīng)濟(jì)。 設(shè)備投資費(fèi)用少設(shè)備投資費(fèi)用少, ,操作簡單操作簡單, ,不存在有機(jī)溶劑殘留問題。不存在有機(jī)溶劑殘留問題。雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)一、一、 雙水相分離理論雙水相分離理論1、雙水相的形成雙水相的形成 v熵增熵增混合混合自發(fā)自發(fā)v分子間作用力分子間作用力-隨著隨著Mr的增加的增加,而增大而增大.v聚合物的不相容性聚合物的不相容性-含有聚合物分子的溶液發(fā)含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象生分相的現(xiàn)象.常用聚合物：常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二

5、醇葡聚糖聚乙二醇無機(jī)鹽系統(tǒng)聚乙二醇無機(jī)鹽系統(tǒng)無毒原則無毒原則2、相圖、相圖 臨界點(diǎn)臨界點(diǎn)(critical point)：當(dāng)當(dāng)系線長度趨于零時系線長度趨于零時, 兩相差兩相差別消失別消失,任何溶質(zhì)在兩相中任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為的分配系數(shù)均為1。如。如C點(diǎn)。點(diǎn)。均相區(qū)兩相區(qū)雙節(jié)線系線u聚合物的分子量越高，相分離聚合物的分子量越高，相分離 所需的濃度越低所需的濃度越低u兩種聚合物的分子量相差越兩種聚合物的分子量相差越 大，雙節(jié)線的形狀越不對稱大，雙節(jié)線的形狀越不對稱。3、物質(zhì)在兩相中的分配、物質(zhì)在兩相中的分配 和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中的分配用分配系數(shù)和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中

6、的分配用分配系數(shù) K表示。表示。 CT K= CB Ct、CB分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度1）表面自由能的影響）表面自由能的影響(大分子物質(zhì)表面性質(zhì)對大分子物質(zhì)表面性質(zhì)對K影響很大影響很大)2）表面電荷的影響）表面電荷的影響(鹽效應(yīng)：兩相系統(tǒng)中如存在鹽鹽效應(yīng)：兩相系統(tǒng)中如存在鹽,對對K影響較大影響較大)3）綜合考慮）綜合考慮（影響因素很多，單因素定量很困難，最佳操作條件靠實(shí)驗(yàn)）（影響因素很多，單因素定量很困難，最佳操作條件靠實(shí)驗(yàn)）4）影響分配平衡的參數(shù)）影響分配平衡的參數(shù) (1)聚合物的影響；聚合物的影響； (2)體系中無機(jī)鹽離子的影響；體系中無機(jī)鹽離子的影響；

7、 (3)體系體系pH的影響；的影響； (4)體系溫度的影響；體系溫度的影響； (5)體系中微生物的影響。體系中微生物的影響。1）表面自由能的影響）表面自由能的影響=p2 p1 2）表面電荷的影響）表面電荷的影響道南電位道南電位(, Donnan potential):實(shí)際雙水相系統(tǒng)中有電解質(zhì)實(shí)際雙水相系統(tǒng)中有電解質(zhì), 當(dāng)這些離子在兩相中當(dāng)這些離子在兩相中K 1, 則兩相間產(chǎn)生電位差則兩相間產(chǎn)生電位差U2，U1相相1 1和相和相2 2的電位的電位 Z+, Z 分別表示一種鹽的正負(fù)離子的離子價分別表示一種鹽的正負(fù)離子的離子價 FF法拉第常數(shù)法拉第常數(shù) T溫度溫度v進(jìn)一步可證明：進(jìn)一步可證明：InK

8、i*= InKi+ ZiF(U2-U1)RTKi*i組分帶電時在體系中的分配系數(shù)組分帶電時在體系中的分配系數(shù) Kii組分不帶電時在體系中的分配系數(shù)組分不帶電時在體系中的分配系數(shù) Zii組分的離子價組分的離子價意義：意義：A 荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.B 由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的同的鹽產(chǎn)生的不同不同,故故k與與Zi的的關(guān)系因鹽而異。關(guān)系因鹽而異。3）綜合考慮）綜合考慮4）影響分配平衡的參數(shù)）影響分配平衡的參數(shù)(1)聚合物的影響聚合物的影響vA A 聚和物的分子量的影響聚和物的分子量的影響

9、當(dāng)聚合物的分子量降低時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的當(dāng)聚合物的分子量降低時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。例如在相。例如在PEGDeX系統(tǒng)中，系統(tǒng)中，PEG的分子量減小，會使分的分子量減小，會使分配系數(shù)增大，而葡聚糖的分子量減小，會使分配系數(shù)降低。配系數(shù)增大，而葡聚糖的分子量減小，會使分配系數(shù)降低。這是一條普遍的規(guī)律，不論何種成相聚合物系統(tǒng)都適用。這是一條普遍的規(guī)律，不論何種成相聚合物系統(tǒng)都適用。(P135)vB B 成相聚和物濃度的影響成相聚和物濃度的影響 當(dāng)接近臨界點(diǎn)時，蛋白質(zhì)均勻地分配于兩相，分配系數(shù)接近當(dāng)接近臨界點(diǎn)時，蛋白質(zhì)均勻地分配于兩相，分配系數(shù)接近于于1。 如成相聚合物的總濃度

10、或聚合物鹽混合物的總濃度增加時，如成相聚合物的總濃度或聚合物鹽混合物的總濃度增加時，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，系線的長度也增加，此時兩相性質(zhì)的差別系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，系線的長度也增加，此時兩相性質(zhì)的差別也增大，蛋白質(zhì)趨向于向一側(cè)分配，即分配系數(shù)或增大超過也增大，蛋白質(zhì)趨向于向一側(cè)分配，即分配系數(shù)或增大超過1，或減小低于，或減小低于1。(2)體系中無機(jī)鹽離子的影響體系中無機(jī)鹽離子的影響v鹽離子在兩相中有不同的分配，因而在兩相間形成電位差，由鹽離子在兩相中有不同的分配，因而在兩相間形成電位差，由于各相要保持電中性，因此對于帶電荷的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的萃取于各相要保持電中性，因此對于帶電荷的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的萃取來說來說

11、,鹽的存在就會使系統(tǒng)的電荷狀態(tài)改變鹽的存在就會使系統(tǒng)的電荷狀態(tài)改變 ,從而對分配產(chǎn)生顯從而對分配產(chǎn)生顯著影響。著影響。 （P137）v鹽的種類對雙水相萃取也有一定的影響鹽的種類對雙水相萃取也有一定的影響 ,因此變換鹽的種類和因此變換鹽的種類和添加其他種類的鹽有助于提高選擇性。添加其他種類的鹽有助于提高選擇性。v在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。在在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。在 PEG/磷酸鹽磷酸鹽 /水水中加入氯化鈉可以使萬古霉素的分配系數(shù)由中加入氯化鈉可以使萬古霉素的分配系數(shù)由 4提高到提高到 1 2 0 ,而而在在 PEG/DeX/水體系中只從水體系中只從 1 . 55提高到

12、提高到 5。(3)體系體系pH的影響的影響vpH會影響蛋白質(zhì)中可以離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白會影響蛋白質(zhì)中可以離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)。質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)。vpH也影響磷酸鹽的離解程度，若改變也影響磷酸鹽的離解程度，若改變H2PO4-和和HPO42-之間之間的比例，也會使相間電位發(fā)生變化而影響分配系數(shù)。的比例，也會使相間電位發(fā)生變化而影響分配系數(shù)。pH的的微小變化有時會使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變微小變化有時會使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變23個數(shù)量級。個數(shù)量級。交 錯 分 配 法交 錯 分 配 法 ( c r o s s partitioning): 當(dāng)加入不當(dāng)加入不同種類

13、的鹽時，由于相間電同種類的鹽時，由于相間電位不同，位不同，lnlnk kpHpH關(guān)系曲線也關(guān)系曲線也不一樣。但在不一樣。但在pIpI處，處，k k應(yīng)相應(yīng)相同，即兩條關(guān)系曲線交于一同，即兩條關(guān)系曲線交于一點(diǎn)。所以點(diǎn)。所以, , 通過測定不同鹽通過測定不同鹽類存在下類存在下lnlnk kpHpH曲線的交點(diǎn)曲線的交點(diǎn), ,可測定蛋白質(zhì)可測定蛋白質(zhì)/ /細(xì)胞器以及細(xì)胞器以及微粒的微粒的pIpI。血清蛋白血清蛋白(4)體系溫度的影響體系溫度的影響 一般地，臨界點(diǎn)附近，溫度對分配率的影響較大，遠(yuǎn)離臨界一般地，臨界點(diǎn)附近，溫度對分配率的影響較大，遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時，影響較小。點(diǎn)時，影響較小。 大規(guī)模操作一般在室溫

14、下進(jìn)行大規(guī)模操作一般在室溫下進(jìn)行, ,不需冷卻。這是基于：不需冷卻。這是基于：(1) (1) 成相聚合物成相聚合物PEGPEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用, ,常溫下蛋白質(zhì)常溫下蛋白質(zhì) 不會發(fā)生變性不會發(fā)生變性; ;(2) (2) 常溫下溶液粘度較低常溫下溶液粘度較低, ,容易相分離容易相分離; ;(3) (3) 常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用。常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用。(5)體系中微生物的影響體系中微生物的影響 結(jié)合結(jié)合P P139圖圖7-107-10和和P P140圖圖7-117-11 二、二、 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 1. 雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取和精制雙水相萃取法常用于

15、胞內(nèi)酶提取和精制目前已知的胞內(nèi)酶約目前已知的胞內(nèi)酶約2600種，但投入生產(chǎn)的很少。種，但投入生產(chǎn)的很少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步是將細(xì)胞原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步是將細(xì)胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細(xì)胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細(xì)胞碎片存在，欲將細(xì)胞碎片除去，過去是依靠離心分離碎片存在，欲將細(xì)胞碎片除去，過去是依靠離心分離的方法，但非常困難。的方法，但非常困難。雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以及酶的進(jìn)一步精制。及酶的進(jìn)一步精制。欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中；欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中；酶的分配系數(shù)

16、應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時，酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時，經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率；經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率； 兩相用離心機(jī)很容易分離。兩相用離心機(jī)很容易分離。工程方面的問題工程方面的問題 在進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用時，需考慮達(dá)到萃取平衡所需的時在進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用時，需考慮達(dá)到萃取平衡所需的時間和兩相分離的設(shè)備。間和兩相分離的設(shè)備。 在兩水相系統(tǒng)中，雖黏度高，但表面張力很低。因而進(jìn)在兩水相系統(tǒng)中，雖黏度高，但表面張力很低。因而進(jìn)行攪拌時很易分散成微滴，故幾秒鐘即能達(dá)到平衡，且行攪拌時很易分散成微滴，故幾秒鐘即能達(dá)到平衡，且能耗也很少。能耗也很少。 兩相分離則比較困難，這是由于兩相

17、密度差低和當(dāng)處理兩相分離則比較困難，這是由于兩相密度差低和當(dāng)處理勻漿液時，粘度較大。由于粘度較高會引起阻塞，可采勻漿液時，粘度較大。由于粘度較高會引起阻塞，可采用自動排渣的噴嘴分離機(jī)。用自動排渣的噴嘴分離機(jī)。PEG:主體回收利用，鹽相中少量殘余超濾或透析除去。主體回收利用，鹽相中少量殘余超濾或透析除去。PEG/鹽更適合用重力沉降；鹽更適合用重力沉降； PEG/DeX多用離心機(jī)多用離心機(jī)。在兩水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以在兩水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。這實(shí)際上是一種

18、反應(yīng)和分離耦合的過程，有時也稱為萃這實(shí)際上是一種反應(yīng)和分離耦合的過程，有時也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化；如果發(fā)生的是一種發(fā)酵過程，則也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化；如果發(fā)生的是一種發(fā)酵過程，則也稱為萃取發(fā)酵，因而此時也可以把兩水相系統(tǒng)稱為兩水相反應(yīng)取發(fā)酵，因而此時也可以把兩水相系統(tǒng)稱為兩水相反應(yīng)器。器。2. 兩水相反應(yīng)器兩水相反應(yīng)器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzyme要進(jìn)行兩水相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)滿足下列條件：要進(jìn)行兩水相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)滿足下列條件：催化劑應(yīng)單側(cè)分配；催化劑應(yīng)單側(cè)分配； 底物應(yīng)分配于催化劑所處的相中；產(chǎn)物應(yīng)分配在另底物應(yīng)分配于催化劑所處的相中；產(chǎn)物應(yīng)分配在另一相中；要有合適的相比。如產(chǎn)物分配在上相中，一相中；要有合適的相比。如產(chǎn)物分配在上相中，則相比要大。則相比要大。這些條件不可能同時滿足，分配理論也不完善，因此這些條件不可能同時滿足，分配理論也不完善，因此常需要根據(jù)試驗(yàn)選擇最優(yōu)系統(tǒng)和操作條件。常需要根據(jù)試驗(yàn)選擇最優(yōu)系統(tǒng)和操作條件。采用兩水相系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)有下列優(yōu)點(diǎn)：采用兩水相系統(tǒng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)有下列優(yōu)點(diǎn)：消除產(chǎn)物抑制，產(chǎn)率高消除產(chǎn)物抑制，產(chǎn)率高與固定床反應(yīng)器相比，不需載體，不存在多孔載體中的